Analysestrategien

Die Arbeitsgruppe Analysestrategien identifiziert und charakterisiert krankheitsassoziierte Nukleinsäuren für deren Anwendung als diagnostische Marker und therapeutische Targets und entwickelt zu diesem Zweck experimentelle Methoden. Ein besonderer Fokus liegt dabei auf der Etablierung geeigneter Sequenzierprotokolle, der Durchführung von Microarray-Analysen sowie der Entwicklung spezieller Anreicherungsverfahren für die Charakterisierung diagnostischer Marker.

Ein weiteres Arbeitsgebiet der Gruppe ist die Identifizierung und funktionelle Charakterisierung nicht-proteinkodierender RNAs (ncRNAs), also jenes Teils des Transkriptoms einer Zelle, der kein Signal für eine Übersetzung in Proteine trägt. Die ncRNAs sind sehr spezifisch reguliert, zeigen eine hohe Zelltypspezifität und treten überraschend häufig mit Krankheiten assoziiert auf. Die Identifizierung klinisch relevanter ncRNAs eröffnet vollkommen neue Perspektiven für die Entwicklung therapeutischer Werkzeuge zum effektiven und zielgerichteten Angriff auf erkrankte Zellen.

Analysemethoden für die Biomarker-Validierung und Testentwicklung

Ein besonderer Fokus der Arbeitsgruppe liegt auf der fortwährenden Etablierung neuer und der Anpassung vorhandener Analysemethoden für spezielle Fragestellungen der Biomarkervalidierung. Dabei kommen hauptsächlich Next-Generation Sequencing, Microarray-Analysen sowie PCR-basierte Verfahren zum Einsatz. Zudem werden Lösungen für die Entwicklung vermarktbarer Testsysteme entwickelt. Dies geschieht in enger Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe RNA-Biomarker, um die Anforderungen für die jeweiligen Biomarkergruppen genau zu definieren.

Next-Generation Sequencing

In der Arbeitsgruppe Analysestrategien stehen mit dem Hochdurchsatz-Sequenzierer HiSequ 2500 sowie dem MiSequ zwei Sequenzierplattformen der Firma Illumina zur Verfügung. Diese finden in einem breiten Methodenspektrum Anwendung. Neben der Durchführung von genom- und transkriptomweiten Sequenzierungen liegt der Fokus auf der Etablierung und Weiterentwicklung spezieller Sequenzierprotokolle, beispielsweise für DNA- / RNA-Capture-Sequenzierung, Amplikon-Sequenzierung, Identifizierung von SNPs und Mutationen sowie für die Charakterisierung kleiner Genome. Die hervoragende Anbindung an die Arbeitsgruppe Bioinformatik ermöglicht anschließend eine hochqualitaive Auswertung dieser Sequenzierdaten.

Microarray-Analysen

Für die hochparallelisierte Durchführung von Genexpressionsanalysen steht eine Microarray-Strecke der Firma Agilent zur Verfügung. Neben den von Agilent angeboten Micorarrays für mRNA-, Exon-, miRNA- und ncRNA-Analysen, können in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Bioinformatik benutzerdefinierte Microarrays für spezielle Fragestellungen designt werden.

Interaktionsstudien

In der Arbeitsgruppe Analysestrategien wurde ein umfangreiches Methodenspektrum aufgebaut, um Einblicke in das zelluläre Interaktom zu bekommen. Für Protein-Protein-Interaktionsstudien wurde die SILAC-Methode erfolgreich eingesetzt. Des Weiteren wurden Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) und RNA-Immunpräzipitation (RIP) für die Untersuchung der Wechselwirkungen von Proteinen mit der DNA bzw. der RNA durchgerührt. Für die Identifizierung von RNA-Bindungspartnern auf RNA-, DNA- und Proteinebene existieren ebenfalls etablierte Protokolle, die derzeit insbesondere für die Suche neuer ncRNA-Bindungspartner verwendet werden.

Ribolution

Das Projekt »RIBOLUTION – Integrierte Plattform für die Identifizierung und Validierung innovativer RNA-basierter Biomarker für die Personalisierte Medizin« ist ein von der Fraunhofer-Zukunftsstiftung geförderter Forschungsverbund. Das Projekt wird durch Prof. Dr. Friedemann Horn am Fraunhofer IZI koordiniert.

Im Projekt RIBOLUTION werden durch genomweite Screening-Verfahren neue RNA-Biomarker für komplexe Erkrankungen (z.B. onkologische, chronisch-entzündliche und degenerative Erkrankungen) identifiziert. Dabei erfasst RIBOLUTION auch sogenannte nichtkodierende RNAs, deren Bedeutung als potenzielle Biomarker erst in jüngster Vergangenheit erforscht wurde.

Im Anschluss an die Screening-Phase werden potenzielle Biomarker hinsichtlich ihrer diagnostischen und prognostischen Aussagekraft beurteilt. Interessant sind dabei solche Biomarker, die als diagnostische Indikatoren eine Erkrankung anzeigen oder ihren Verlauf bzw. das Ansprechen auf Therapien prognostizieren können.

Zusätzlich wird der Prozess des Biomarker-Screenings durch RIBOLUTION mit Hilfe technischer Innovationen optimiert und perfektioniert.

Endokarditis

In Kooperation mit dem Herzzentrum Leipzig und dem Institut für Mikrobiologie der Universität Leipzig wird die Fragestellung einer verbesserten Erregerdiagnostik bei einer infektiösen Endokarditis bearbeitet.

Mittels genomweiter Sequenzierung werden Krankheitserreger sowohl direkt auf den infizierten Herzklappen als auch im Blut der Patienten identifiziert und mit den Befunden aus dem mikrobiologischen Analyselabor verglichen.

Ziel ist es, in Ergänzung zu den bereits zur Verfügung stehenden mikrobiologischen Analysen, eine optimierte Behandlungsstrategie für jeden einzelnen Patienten abzuleiten. Dabei stehen vor allem die bisher nur unzureichend abschätzbare Notwendigkeit einer Operation bzw. der Einsatz der passenden Antibiose im Vordergrund.

Mammakarzinom

In einem gemeinsamen Projekt mit der Universitäts-Frauenklinik Essen werden Gene, welche für die Entstehung und die Metastasierung des Mammakarzinoms relevant sind, hinsichtlich ihrer Expressionsmuster und des Auftretens von Mutationen untersucht.

Dafür wurde in der Arbeitsgruppe ein spezieller DNA-Capture-Ansatz entwickelt, der es ermöglicht, krankheitsrelevante DNA-Abschnitte aus Primärtumoren und Metastasen von Patientinnen gezielt anzureichern und nachfolgend zu sequenzieren. Gleichzeitig werden am Klinikum in Essen zirkulierende Tumorzellen (CTCs) aus Patientenblut isoliert, in denen die Expression Mammakarzinom-relevanter Gene mittels PCR untersucht wird.

Die Daten dieser Studien sollen zeigen, wie sich Primärtumore und Metastasen in ihren Mutations- und Expressionsmustern unterscheiden. Zudem wird untersucht, ob CTCs für die Diagnose des Mammakarzinoms genutzt werden können und Hinweise für eine zielgerichtete Behandlung liefern. Dadurch könnten komplizierte operative Entnahmen von Tumorgewebe überflüssig werden.

Funktionelle Analysen zur Rolle von nichtkodierenden RNAs in Multiplem Myelom, Glioblastom und Alzheimer

In den vergangenen Jahren konnte durch genomweites Next-Generation-Sequencing eine Vielzahl an nicht proteinkodierenden RNAs (ncRNAs) identifiziert werden. Viele dieser ncRNAs haben offensichtlich einen Einfluss auf die Entstehung und den Verlauf von Krankheiten. Dennoch ist ein Großteil dieser Transkripte kaum funktionell charakterisiert.

Der Schwerpunkt dieses Projekts liegt daher auf der umfassenden funktionellen Analyse solcher ncRNAs in verschiedenen immunologisch und neurologisch relevanten Zellsystemen. Durch den gezielten Knockdown einer ncRNA ist es in nachfolgenden Untersuchungen möglich, ihren Einfluss auf die Vitalität, Apoptoserate, Proliferation, Adhäsion und Migration von Zellen zu bestimmen. Des Weitern kann die Expression und Lokalisation von ncRNAs innerhalb von Geweben, aber auch auf Einzelzellebene visualisiert und quantifiziert werden. Vertiefend dienen In-vivo-Interaktionsstudien der Identifizierung von ncRNA-Bindungspartnern auf RNA-, DNA- und Proteinebene. Ziel ist es, die molekularen und zellulären Wirkungsmechanismen von ncRNAs aufzuklären, um deren Rolle in diversen Krankheitsmodellen besser zu verstehen und mögliche therapeutische Ansatzpunkte herauszuarbeiten.

Abgeschlossenes Projekt: Diagnostik zirkulierender Tumorzellen

Dieses SAB-geförderte F&E-Verbundvorhaben wurde von der ApoCell Europe GmbH gemeinsam mit verschiedenen Arbeitsgruppen des Fraunhofer IZI durchgeführt. Das Ziel war die Entwicklung innovativer Technologien zur Erfassung und Charakterisierung zirkulierender Tumorzellen. Damit soll die Entwicklung signifikant verbesserter Tumordiagnostika und innovativer Therapien vorangetrieben werden.

  • Illumina Sequenzierplattform Hiseq 2500 (Ultra-High-Throughput Sequencing System)
  • Illumina Sequenzierplattform Miseq
  • Microlab STARlet (Hamilton, zur automatisierten Probenvorbereitung für die Sequenzierung)
  • Qiacube (halbautomatisierte Nukleinsäureextraktion und -aufreinigung)
  • Microarrayscanner (Agilent, Affymetrix)
  • Perkin Elmer Labchip GX (Qualitätsbestimmung von Nukleinsäuren, integrierbar in Automatisierung)
  • Perkin Elmer Labchip DS (Quantifizierung von Nukleinsäuren, integrierbar in Automatisierung)
  • Agilent Bioanalyzer (Qualitätsbestimmung von Nukleinsäuren und Proteinen)
  • Nanodrop (Quantifizierung von Nukleinsäuren)
  • Qubit 2.0 (sehr sensitive fluorometrische Quantifizierung spezifischer Nukleinsäuren)
  • Covaris M220 Focused-Ultrasonicator™ (Fragmentierung von Nukleinsäuren, Paraffinentfernung aus FFPE-Proben)

  • Hackermüller J, Reiche K, Otto C, Hösler N, Blumert C, Brocke-Heidrich K, Böhlig L, Nitsche A, Kasack K, Ahnert P, Krupp W, Engeland K, Stadler PF, Horn F. Cell cycle, oncogenic and tumor suppressor pathways regulate numerous long and macro non-protein-coding RNAs. Genome Biology. 2014 Mar 4;15(3):R48. DOI http://dx.doi.org/10.1186/gb-2014-15-3-r48
  • Blumert C, Kalkhof S, Brocke-Heidrich K, Kohajda T, von Bergen M, Horn F. Analysis of the STAT3 interactome using in-situ biotinylation and SILAC. J Proteomics. 2013 Dec 6;94:370-86. DOI dx.doi.org/10.1016/j.jprot.2013.08.021
  • Bauer K, Kretzschmar AK, Cvijic H, Blumert C, Löffler D, Brocke-Heidrich K, Schiene-Fischer C, Fischer G, Sinz A, Clevenger CV, Horn F. Cyclophilins contribute to Stat3 signaling and survival of multiple myeloma cells. Oncogene. 2009 Aug 6;28(31):2784-95. DOI dx.doi.org/10.1038/onc.2009.142
  • Cvijic H, Bauer K, Löffler D, Pfeifer G, Blumert C, Kretzschmar AK, Henze C, Brocke-Heidrich K, Horn F. Co-activator SRC-1 is dispensable for transcriptional control by STAT3. Biochem J. 2009 Apr 28;420(1):123-32. DOI dx.doi.org/10.1042/BJ20081989
  • Löffler D, Brocke-Heidrich K, Pfeifer G, Stocsits C, Hackermüller J, Kretzschmar AK, Burger R, Gramatzki M, Blumert C, Bauer K, Cvijic H, Ullmann AK, Stadler PF, Horn F. Interleukin-6 dependent survival of multiple myeloma cells involves the Stat3-mediated induction of microRNA-21 through a highly conserved enhancer. Blood. 2007 Aug 15;110(4):1330-3.