Fraunhofer-Institut für Zelltherapie und Immunologie IZI
Fraunhofer-Institut für Zelltherapie und Immunologie IZI

Next-Generation Sequencing, Single-cell RNA-Seq und Spatial Transcriptomics

Die Arbeitsgruppe Next-Generation Diagnostics identifiziert und charakterisiert krankheitsassoziierte Nukleinsäuren (DNA und RNA) für deren Anwendung als diagnostische Marker und therapeutische Targets. Dafür besitzt die AG eine langjährige Expertise im Bereich experimenteller Methoden der Hochdurchsatzsequenzierung (Next-Generation Sequencing). Ein weiterer Fokus liegt auf PCR-basierten molekularbiologischen Analysen sowie der optimalen Gewinnung und Vorbereitung des Untersuchungsmaterials z. B. aus Patientenproben, Tiermodellen oder Organoid- und Zellkulturen.

Die Hochdurchsatzsequenzierung (Next-Generation Sequencing) ist eine Technologie, um die Abfolge der Nukleotide in ganzen Genomen oder in bestimmten Bereichen der DNA oder RNA zu bestimmen. Die rasante Entwicklung der Technologie, verbunden mit einer deutlichen Kostensenkung, hat völlig neue Möglichkeiten der Nukleinsäureanalytik eröffnet, so können beispielsweise die Transkriptionsmuster und Oberflächenmoleküle tausender Zellen bis auf Einzelzellebene aufgelöst werden (scRNA-Seq, CITE-Seq) und gleichzeitig mit einer Bildgebung kombiniert werden (Spatial Transcriptomics).  Diese Methoden bieten ein breites Anwendungsspektrum für den Bereich LifeScience. Ein Beispiel ist die Entwicklung und die begleitende Diagnostik von CAR-Therapien.

Klassische NGS-Methoden

  • Vollständige Transkriptomsequenzierung (mRNA, totalRNA): Erstellung von Genexpressionsprofilen für biologische und/oder medizinische Fragestellungen (z.B. Krebserkrankungen, seltene Syndrome) sowie translationale Forschung
  • Amplikon-basierte Sequenzierung: Sequenzierung ausgewählter genomischer Regionen für die Präzisionsonkologie sowie Testung auf Erbkrankheiten
  • Genomsequenzierung / Exomsequenzierung: Genomprofilierung für Studien zu Krebserkrankungen sowie translationale Forschung
  • Sequenzierung kleiner Genome: Gezielte oder vollständige Sequenzierung von Genomen mit geringer Komplexität (wie Bakterien, Viren oder Phagen)

Hochauflösende (Einzelzell-) Sequenzierung und Spatial transcriptomics

Einzelzellsequenzierung (Single-cell RNA-sequencing):

Erstellung von Transkriptom-Profilen und parallele Detektion von Oberflächenproteinen auf Einzelzellebene

Anwendungsbeispiel:

  • Funktionskontrolle therapeutischer CARs (z.B. CAR-T-Zellen, CAR-NK-Zellen) und Monitoring des Therapieerfolgs in Patientenproben

Verfügbare Assays:

  • GEM-X Universal 3' Gene Expression (komplette Transkriptomanalyse) – optional in Kombination mit ATAC-Seq
  • GEM-X Universal 5‘ Gene Expression (komplette Transkriptomanalyse) – optional in Kombination mit Single Cell Immune Profiling:
  • T-Zell- und / oder B-Zell Rezeptoranalyse
  • Analyse benutzerdefinierter Oberflächenproteine
  • Flex Gene Expression (Sonden-basierter Assay für kodierende Bereiche des Transkriptoms) – optional in Kombination mit der Analyse von CAR-Konstrukten (benutzerdefiniertes Sondendesign)

 

Räumliche Sequenzierung (Spatial transcriptomics)

Räumlich aufgelöste Genexpressionsprofile in Geweben bis zur Einzelzellauflösung

Anwendungsbeispiel:

  • Parallele molekulare und bildgebende Charakterisierung von Tumor, tumorinfiltrierenden Immunzellen und Tumormikroumgebung

Verfügbare Assays:

  • Visium HD Spatial Gene Expression (für FFPE-Gewebe)
  • Visium Spatial Gene Expression (FFPE- und Kryogewebe)

 

Integrationsstellenanalyse (Integration site analysis)

Bestimmung der Integrationsstellen im Genom nach dem Einbringen von genetischem Material in die Zellen, mittels verschiedener Technologien (lentiviral, gammaretroviral, Sleeping Beauty-Transposon) 

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    • Braun T, Rade M, Merz M, Klepzig H, Große F, Fandrei D, Pham NN, Kreuz M, Kuhn CK, Kuschel F, Löffler D, Meinel J, Heger E, Schweinsberg V, Pflug N, Platzbecker U, Hallek M, Holtick U, Köhl U, Scheid C, Reiche K, Herling M, Richardson T.  Multiomic profiling of T cell lymphoma after therapy with anti-BCMA CAR T cells and GPRC5D-directed bispecific antibody. Nat Med. 2025 Apr;31(4):1145-1153. doi: 10.1038/s41591-025-03499-9. Epub 2025 Feb 21. 
    • Rade M, Kreuz M, Borkowetz A, Sommer U, Blumert C, Füssel S, Bertram C, Löffler D, Otto DJ, Wöller LA, Schimmelpfennig C, Köhl U, Gottschling AC, Hönscheid P, Baretton GB, Wirth M, Thomas C, Horn F, Reiche K. A reliable transcriptomic risk-score applicable to formalin-fixed paraffin-embedded biopsies improves outcome prediction in localized prostate cancer. Mol Med. 2024 Feb 1;30(1):19. doi: 10.1186/s10020-024-00789-9 
    • Rade M, Böhlen S, Neuhaus V, Löffler D, Blumert C, Merz M, Köhl U, Dehmel S, Sewald K, Reiche K. A time-resolved meta-analysis of consensus gene expression profiles during human T-cell activation. Genome Biol. 2023, 24(1): 287. doi: 10.1186/s13059-023-03120-7 
    • Schimmelpfennig C, Rade M, Füssel S, Löffler D, Blumert C, Bertram C, Borkowetz A, Otto D J, Puppel S-H, Hönscheid P, Sommer U, Baretton G B, Köhl U, Wirth M, Thomas C, Horn F, Kreuz M, Reiche K. Characterization and evaluation of gene fusions as a measure of genetic instability and disease prognosis in prostate cancer. BMC Cancer 2023, 23, article 575. doi: 10.1186/s12885-023-11019-6 
    • Schmidt J R, Haupt J, Riemschneider S, Kämpf C, Löffler D, Blumert C, Reiche K, Koehl U, Kalkhof S, Lehmann J. Transcriptomic signatures reveal a shift towards an anti-inflammatory gene expression profile but also the induction of type I and type II interferon signaling networks through aryl hydrocarbon receptor activation in murine macrophages. Front Immunol 2023, 14: article number 1156493. doi: 10.3389/fimmu.2023.1156493 
    • Anders I M, Schimmelpfennig C, Wiedemann K, Löffler D, Kämpf C, Blumert C, Reiche K, Kunz M, Anderegg U, Simon J-C, Ziemer M. Atypical fibroxanthoma and pleomorphic dermal sarcoma – gene expression analysis compared with undifferentiated cutaneous squamous cell carcinoma. J Dtsch Dermatol Ges 2023, 21 (5): 482-491. doi: 10.1111/ddg.15006 
    • Haehnel S, Rade M, Kaiser N, Reiche K, Horn A, Loeffler D, Blumert C, Rapp F, Horn F, Meixensberger J, Renner C, Mueller W, Gaunitz F, Bechmann I, Winter K. RNA sequencing of glioblastoma tissue slice cultures reveals the effects of treatment at the transcriptional level. FEBS Open Bio. 2022 Feb;12(2):480-493. doi: 10.1002/2211-5463.13353 .
    • Walcher L, Kistenmacher AK, Sommer C, Böhlen S, Ziemann C, Dehmel S, Braun A, Tretbar US, Klöß S, Schambach A, Morgan M, Löffler D, Kämpf C, Blumert C, Reiche C, Beckmann J, König U, Standfest B, Thoma M, Makert GR, Ulbert S, Kossatz-Böhlert U, Köhl U, Dünkel A, Fricke S. Low Energy Electron Irradiation Is a Potent Alternative to Gamma Irradiation for the Inactivation of (CAR-)NK-92 Cells in ATMP Manufacturing. Front Immunol. 2021 Jun4:12:684052. doi: 10.3389/fimmu.2021.684052, eCollection 2021.
    • Kreuz M, Otto DJ, Fuessel S, Blumert C, Bertram C, Bartsch S, Loeffler D, Puppel SH, Rade M, Buschmann T, Christ S, Erdmann K, Friedrich M, Froehner M, Muders MH, Schreiber S, Specht M, Toma MI, Benigni F, Freschi M, Gandaglia G, Briganti A, Baretton GB, Loeffler M, Hackermüller J, Reiche K, Wirth M, Horn F. ProstaTrend-A Multivariable Prognostic RNA Expression Score for Aggressive Prostate Cancer. Eur Urol. 2020 Sep;78(3):452-459. doi: 10.1016/j.eururo.2020.06.001.