Liganden-Entwicklung

Schwerpunkte der Arbeitsgruppe sind molekulare Interaktionen von Biomolekülen, insbesondere die Identifizierung von Peptiden z.B. für Tumortargeting und Antikörpercharakterisierung. Eine neue Phage-Display-Technologie wird kombiniert mit modernsten Geräten und Messmethoden. Diese ermöglicht eine in silico Datenauswertung für Epitop-Mapping, u. a. von Antikörpern oder dem Immunom von Patientenseren, z. B. in der Allergieforschung, und das erfolgreiche Identifizieren von Peptidliganden zur Charakterisierung komplexer Strukturen als Alternative zu Antikörpern. Die Anwendungen umfassen die Markierung von Krebszellen / -geweben bis hin zum Verhalten von (Stamm-) Zellen in Kultur und Lagerung.

Phage Display

Bei modernen Verfahren zur Wirkstoffforschung ist man in den letzten Jahrzehnten dazu übergegangen, gewaltige Sammlungen von verschiedenen Substanzen von kleinen Wirkstoffmolekülen anzulegen und bei Bedarf diese Millionen Substanzen in kleinstem Maßstab zu testen. Dabei stoßen die Forscher häufig an die Grenzen der wirtschaftlichen und physikalischen Machbarkeit und auch der gewünschte Erfolg ist wenn überhaupt nur in vielen Jahren harter Arbeit zu erreichen.

Die strukturelle Vielfalt von größeren Peptiden, Proteinen und Antikörpern ist um ein Vielfaches größer als die traditioneller Wirkstoffe. Es ist aussichtslos alle denkbaren Varianten eines solchen Moleküls chemisch herzustellen. Mit modernen Syntheseverfahren kann man aber Genmischungen herstellen, die so in Bakteriophagen (Viren der Bakterien) eingeschleust werden, dass sich jeweils ein einzelnes Gen für eine Peptid/Protein-Variante in einen Phagenpartikel und das jeweilige Peptid/Protein als Produkt dieses Genes sich auf der Oberfläche des selben Bakteriophagenpartikels befindet. Das hat dem Verfahren den Namen Phage Display eingebracht. Es ist kein Problem Genmischungen mit vielen Milliarden Varianten herzustellen. Etwas aufwendiger ist die Herstellung der entsprechenden Bakteriophagenmischungen durch Klonierung, ohne die Vielfalt in großem Umfang zu verlieren. In einem Kubikzentimeter (viertel Fingerhut) befinden sich letztlich viele Milliarden solcher Bakteriophagen-Varianten. Aus diesen werden durch Bindung an ein Zielmolekül einzelne Bakteriophagen mit passenden Peptiden »herausgefischt« und wieder in Bakterien vermehrt werden. Bei Wiederholung dieses Schritts können bindende Peptide angereichert werden. Wie ein Goldwäscher holt man die Nuggets aus dem ansonsten tauben Gestein, allerdings würde der Goldwäscher viel dafür geben, diese anschließend vermehren zu können. Immerhin wurde hierdurch aber der Begriff »Panning« für die Selektion von Bindern im Page Display geprägt.

Der Nachteil dieser Bibliotheken ist trotzdem, dass auch Sie nur einen Bruchteil der Varianten eines Peptids abdecken. Ein Peptid aus 10 Aminosäuren, das ist die Größenordnung kleiner Peptidhormone, ist in 2010 Varianten denkbar. Das sind mit 1013 mögliche Sequenzen, die von einer normalen Peptidbibliothek im Phage Display Format praktisch und theoretisch nicht abgedeckt werden können. Wir setzen daher auf neue Methoden:

  • (Re-)Kombinatorisches Phage Display mit Peptiden
  • Next Generation Libraries

(Re-)Kombinatorisches Phage Display mit Peptiden

In der Evolution führt in der Regel der direkteste Weg zu neuen Proteinen über die Rekombination von Genen und nicht über zufällige Änderungen durch einzelne Mutationen. Dieses wurde bereits vor vielen Jahren von verschiedenen Wissenschaftlern erkannt. Forscher wie W.P.C. Stemmer (seinerzeit Affymax Inc.) führten mehr oder weniger gerichtete Rekombinationsverfahren ein. Ein Verfahren zur gerichteten Rekombination auch von Peptidgenen wurde von Prof. J. Collins entwickelt und bei der Firma Cosmix GmbH (Braunschweig) von Dr. Szardenings und Kollegen auch für Antikörper und Proteine weiterentwickelt. Diese Bibliotheken lassen nicht nur die Herstellung ungewöhnlich großer Ausgangsbibliotheken zu (Peptidbibliothek > 1010 Sequenzen) sondern erlauben durch schrittweise Rekombination einen Sequenzraum von > 1015 Sequenzen zu erschließen. Dadurch kann zumindest theoretisch jede beliebige Peptidsequenz aus 10 Aminosäuren gefunden werden. Praktische Ergebnisse zeigen tatsächlich Homologien von 9–10 Aminosäuren zwischen selektierten Bindern.

(Re-)Kombinatorisches Phage Display mit Antikörpern

Rekombination von Antikörperbibliotheken erfordert spezielle Expressionsvektoren und besondere Klonierungen. Wir können dieses Verfahren zur Identifizierung von Bindern aus cDNA Bibliotheken sowie validierte naive humane Fab Bibliotheken anbieten.

Next Generation Peptide Phage Display Libraries

Am Fraunhofer IZI versuchen wir zurzeit jahrzehntelange Erfahrung im Umgang mit Peptidbibliotheken in neue Werkzeuge und Bibliotheken umzusetzen und zu kombinieren. Phagemidvektoren wurden für die Klonierung der Genfragmente optimiert und erlauben ganz neue Steigerungen der Selektionseffizienz. Wir haben Zugang zu den besten zurzeit verfügbaren DNA-Synthese-Techniken unserer Partner und konnten durch intelligentes Design sonst unerwünschte Sequenzduplikate beseitigen. Diese Bibliotheken bedeuten für manche bisher schwierige oder unlösbare Anwendung neue Hoffnung auf Erfolg.

Epitop / Mimotop Mapping

Peptid Phage Display Bibliotheken von der Größe, wie sie am Fraunhofer IZI zur Verfügung stehen, erlauben eine rasche und zuverlässige Identifizierung von Epitopen und Mimotopen sowohl von monoklonalen als auch polyklonalen Antikörpern. Die gefundenen Peptide liefern nicht nur wertvolle Information zur Bindestelle am Protein sondern sie können auch in serologischen Assays und zur Reinigung von rekombinanten Antikörpern oder spezifischen Antikörpern aus polyklonalen Mischungen verwendet werden.

Diese Routinearbeit wird wegen ihrer kurzen Bearbeitungszeit und leicht überprüfbaren Ergebnissen gern von Firmen im Rahmen der Entwicklung von Antikörpern gewünscht.

Gerätepool

Das Fraunhofer IZI verfügt insgesamt über eine ausgezeichnete Grundausrüstung an Geräten, die bei den sehr verschiedenen Projekten der Arbeitsgruppe zum Einsatz kommen. Für die Arbeitsgruppe Liganden-Entwicklung sind die folgenden Geräte von besonderer Bedeutung:

  • ÄKTA Avant – Zur Reinigung von Proteinen aus komplexen Mischungen, z.B. Antikörper aus Seren oder Allergenen aus Rohstoffen, verwendet die Arbeitsgruppe eines der besten verfügbaren Geräte für die Optimierung von Proteinreinigungsverfahren.
  • Bioreaktoren – Zur Kultivierung größerer Mengen von E.coli für die Verpackung von Phage Display Bibliotheken in erstklassiger Qualität.
  • Zellsorter / FACS – Für die Durchführung von Selektionsexperimenten an lebenden Zellen und die Validierung der Ergebnisse.
  • BIACORE® – Zur direkten Messung von Protein-Protein Wechselwirkungen als Teil unserer Projekte.

Epitop / Mimotop Mapping

Peptid Phage Display Bibliotheken von der Größe, wie sie am Fraunhofer IZI zur Verfügung stehen, erlauben eine rasche und zuverlässige Identifizierung von Epitopen und Mimotopen sowohl von monoklonalen als auch polyklonalen Antikörpern. Die gefundenen Peptide liefern nicht nur wertvolle Information zur Bindestelle am Protein sondern sie können auch in serologischen Assays und zur Reinigung von rekombinanten Antikörpern oder spezifischen Antikörpern aus polyklonalen Mischungen verwendet werden.

Diese Routinearbeit wird wegen ihrer kurzen Bearbeitungszeit und leicht überprüfbaren Ergebnissen gern von Firmen im Rahmen der Entwicklung von Antikörpern gewünscht.

ZellFix – Oberflächenaktivierung besser als Plasma?

In einem gemeinsamen Projekt mit dem Fraunhofer IFAM wurde entdeckt, dass eine einfache, mit zellbiologischen Verfahren kompatible Enzymreaktion genutzt werden kann, um Peptidliganden kovalent an ihre Rezeptoren auf Zellen zu binden. Daraufhin initiierten beide Institute das von der Fraunhofer-Gesellschaft geförderte Projekt ZELLFIX, um die gleiche Reaktion zur Modifikation von Oberflächen einzusetzen.

Zellen haften ungern auf den Polymeren von Kulturschalen. Normalerweise werden Polystyroloberflächen mit Plasma behandelt, was aber auch zu unerwünschten, teilweise toxischen Nebenprodukten führt. Mit dem neuen Verfahren könnten zum einen Peptid- und Proteinliganden die Anheftung der Zellen verbessern und zum anderen einzelne Oberflächenproteine kovalent direkt an die Platten gebunden werden, wie dieses auch auf plasmaaktivierten Oberflächen geschieht.

Im Projekt ZELLFIX wurden zunächst die ursprünglichen Annahmen experimentell bestätigt. Sogar abgegrenzte Bereiche von Zellkulturschalen lassen sich mit geringem Aufwand so modifizieren, dass Zellen nur dort anhaften. Diese Methode ist auch geeignet, um die lokale Anheftung von Proteinen selbst bei handelsüblichen, bereits plasmaaktivierten, Oberflächen zu verbessern.

Diese Verfahren werden bereits mit Partnern aus Industrie und Fraunhofer-Gesellschaft für erste spezielle Anwendungen erprobt. Zudem konnten über den biologischen und medizinischen Bereich hinaus zusätzlich neue Anwendungen identifiziert werden.

LowAllergen – Reduktion der Allergenität von Lebensmitteln

Dieses Projekt wird Fraunhofer-intern für drei Jahre mit mehreren Millionen Euro gefördert. Unter der Leitung der Lebensmittelspezialisten des Fraunhofer IVV in Freising arbeiten das Fraunhofer IZI, das Fraunhofer ITEM (Hannover), das Fraunhofer IME (Aachen) sowie die Hautklinik der Universitätsklinik in Leipzig zusammen.

Das LowAllergen-Projekt schafft die Grundlagen für die Herstellung von Lebensmittelzutaten mit reduzierten allergenen Eigenschaften. Substanzen mit allergenem Potenzial in Lebensmitteln sind eine Einschränkung und eine durchaus lebensgefährliche Bedrohung für Allergiker. Ihr zunehmender, teilweise versteckter Einsatz und die damit verbundene Exposition der Verbraucher erhöhen zudem das Risiko, dass auch gesunde Personen neue Allergien entwickeln.

Die Minderung des allergenen Potenzials von Zutaten wäre daher ein wesentlicher Beitrag zur Lebensmittelsicherheit. Voraussetzung hierfür sind aber geeignete Prozesse zur Reduzierung der allergenen Eigenschaften von Lebensmittelzutaten sowie Nachweisverfahren, die das allergene Potenzial von Lebensmitteln sicher und reproduzierbar bestimmen.

Existierende Testverfahren für den Einsatz in der Lebensmittelindustrie sind zwar für den grundsätzlichen Nachweis von allergenen Bestandteilen geeignet, sagen jedoch nichts über deren spezifische Allergenität aus. Zudem basiert die Bewertung von Prozessen zur Herstellung hypoallergener Proteinzutaten bislang auf der Verwendung schwer erhältlicher und uneinheitlicher humaner Blutseren. Daher ist die Entwicklung hypoallergener Nahrung bisher aufwändig und unspezifisch und bleibt auf wenige Produktgruppen, z.B. Babynahrung, beschränkt. Die Hauptstrategie für Allergiker ist nach wie vor die konsequente Vermeidung von Lebensmitteln mit potenziell allergenen Zutaten. Im Rahmen des MAVO-Projekts LowAllergen werden am Beispiel der Sojabohne (Glycine max) erstmalig neue diagnostische und lebensmitteltechnische Verfahren entwickelt und erprobt, die das allergene Potenzial von Lebensmittelbestandteilen gezielt und wirkungsvoll erkennen und reduzieren sollen.

Zur Identifizierung der molekularen Strukturen (Epitope), die von allergieauslösenden Antikörpern erkannt werden, sollen nicht wie bisher nur einzelne Proteine global untersucht werden, sondern eine detaillierte Charakterisierung auf unterschiedlichen Ebenen erfolgen. Drei komplementäre Ansätze liefern dabei Informationen über die allergenen Epitope der Sojaproteine und ermöglichen die Entwicklung von Nachweismethoden, die erstmalig auf standardisiert herstellbaren monoklonalen Antikörpern beruhen werden.Die erstmalige exakte Identifizierung und Nachweisbarkeit allergener Epitope auf molekularer Ebene ermöglichen somit die Entwicklung von Verfahrenskonzepten zur Gewinnung hypoallergener Lebensmittelzutaten. Hierfür werden spezifische chemische, physikalische oder enzymatische Verfahren zur Reduktion des allergenen Potenzials bei weitgehendem Erhalt der sensorischen und funktionellen Eigenschaften der Lebensmittelzutaten verfolgt.

Die Arbeitsgruppe Liganden-Entwicklung ist für Teile der Proteinreinigung und vor allem die Identifizierung von Epitopen und Mimotopen der allergieauslösenden Soja-Proteine verantwortlich.

Neue Peptidtechnologien

Die Entwicklung neuer Peptidliganden endet natürlich nicht bei zum Beispiel der Auffindung von Liganden für Rezeptoren. In mehreren Bereichen sind wir mit Partnern aktiv bei der Erprobung neuer Technologien. Trotz hoher Selektivität haben Peptide häufig eine relativ geringe Bindungsaffinität. Wir haben ein Verfahren entwickelt, mit dem Peptide schonend an ihre Bindungspartner gekoppelt werden können und damit können auch Zellen für den Zellsorter hinreichend stabil markiert werden. Eine andere Möglichkeit ist die Verankerung von mehreren Peptiden auf größeren Strukturen. Wir testen dafür zum Beispiel in Projekten Polymere und Nanopartikel genauso wie die Verwendung in Proteomics und FACS Analyse von Zellen.

Peptidkartierung und Seren

Mädchen mit Blumen
© Foto MEV-Verlag, Germany

Allergien sind übermäßige Abwehrreaktionen des Immunsystems auf ansonsten harmlose Umweltstoffe, z.B. Blütenpollen.

Mit Hilfe des Phage Display vonPeptiden lassen sich am Fraunhofer IZI aus einer Zahl von bis zu über 1015 Sequenzen Peptidsequenzen identifizieren, die bestimmte Antikörper binden. Dabei wird es am Fraunhofer IZI anhand der Vielzahl von gefundenen Sequenzen nicht nur deutlich, welchen Teil eines Proteins von einem Antikörper erkannt wird, sondern auch, welche Varianz der bindenden Sequenzen erlaubt ist. Von so vielen Bindern lassen sich leicht diejenigen auswählen, die für verschiedene Anwendungen am besten geeignet sind. Außerdem lassen sich Kreuzreaktionen in diagnostischen Anwendungen und die Möglichkeit zur Erkennung von mutierten Proteinen vorhersagen.

Im Moment wird diese Methode auf die Untersuchung von Seren erweitert, die von Allergiepatienten stammen. Davon werden neue Chancen zur frühzeitigen Diagnostik von Allergieerkrankungen erwartet. Damit könnten durch rechtzeitige Gabe von Medikamenten vor allem bei Kindern schwere Verläufe von Allergien verhindert werden.

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