Zell- und Gentherapieentwicklung

Die derzeitigen Protokolle für die autologe Ex-vivo-Gen- und Zelltherapie umfassen eine arbeits-, zeit- und kostenintensive Versorgungs­kette. Dabei werden die Zellen der Patient*innen in der Regel in einem spezialisierten klinischen Zentrum entnommen und zunächst an eine zentrale Herstellungsstätte geliefert. Dort werden die Zellen genetisch modifiziert, expandiert und umfassenden Qualitätskontrollen unterzogen. Das kryo­konservierte Zellprodukt wird anschließend wieder an das Krankenhaus zurückgeschickt und die Therapie durchgeführt. Um den zukünftig wachsenden Bedarf decken zu können und einen breiten Zugang zu Zell- und Gentherapien zu ermöglichen, werden derzeit Herstellungsprotokolle entwickelt, die Produktions­zeit und -kosten signifikant reduzieren. 

Die derzeitigen Methoden für die gen­technische Herstellung therapeutischer Zellprodukte weisen verschiedene Limitierungen auf. Dazu gehören die fehlende lang­fristige Expression von Transgenen, das Risiko der Insertions-Onkogenese und anderer schäd­licher Mutationen des Genoms der Empfänger­zellen. Zudem ist die Herstellung genetischer Vektoren in pharmazeutischer Qualität mit erheblichen Kosten verbunden.

Nichtvirale Gentransfer-Technologien sind eine vielversprechende Option, um die Herstellung gentechnisch veränderter Zellen deutlich kosten­günstiger zu gestalten. 

Die einfachsten, aus der Natur bekannten, Gentransfervehikel sind Transposons. Die Genomintegration durch Transposase-­Enzyme macht Transposons zu einzigartigen nicht­viralen Vektorsystemen, die als Werkzeuge für vielseitige Anwendungen in der Gen­technik, einschließlich der Gentherapie, eingesetzt werden können. Eines der am besten charakterisierten Transposons, das Sleeping-Beauty-Transposon, verfügt über ein großes Potenzial, sichere und wirtschaftlich trag­fähige Zell­therapeutika zu entwickeln. Bislang jedoch stellen die suboptimale Effizienz der genomischen Integration in bestimmten menschlichen Zelltypen, die unzureichend kontrollierte Transposase-Expression in genveränderten Zellen und das Risiko der Insertions­mutagenese durch zufällige genomweite Integration, noch relevante Ein­schränkungen der Technologie dar. 

Im Rahmen des Projekts sollen Wirksamkeit und Sicherheit der Sleeping-Beauty-Transposon-Technologie verbessert und diese für die klinische Entwicklung vorbereitet werden.

Um an die ersten Erfolge T-Zell-basierter Krebsimmuntherapien anzuknüpfen und sowohl deren Anwendungsspektrum wie auch -breite zu erweitern, rückt eine weitere Art von Immunzellen in den Fokus biomedizinischer Forschung – Natürliche Killerzellen (NK-Zellen).

Im Gegensatz zu T-Zellen, eignen sich NK-Zellen aufgrund ihrer sicheren Übertragbarkeit zwischen gesunden Spenderinnen und Spendern und an Krebs erkrankten Personen auch für allogene Therapieformen. Dies ermöglicht eine standardisierbare und kosteneffiziente Vorratsproduktion, bei der die Produkte bedarfsgerecht abgerufen werden können.

Bevor allogene NK-Zellen als effizientes Medikament zum Einsatz kommen, müssen diese genetisch modifiziert und mit neuen Rezeptoren, die Krebszellen erkennen können, ausgestattet werden. Ein Fokus der strategischen Partnerschaft zwischen den Forschenden des Universitätsklinikums Oslo und des Fraunhofer-Instituts für Zelltherapie und Immunologie liegt dabei auf modifizierten T-Zell-Rezeptoren (TCR), die in der Lage sind, Fragmente intrazellulärer Krebsantigene auf HLA-I-Komplexen zu erkennen. Im Vergleich zu CAR (Chimeric Antigen Receptor)-T-Zellen, die nur Oberflächenantigene erkennen können, wird dadurch das Spektrum möglicher Zielantigene um ein Vielfaches erweitert.

Um entsprechende Forschungsergebnisse möglichst schnell in die klinische Anwendung zu überführen, werden bei sämtlichen Entwicklungsschritten die Prozesslösungen für die pharmazeutische Produktion direkt mitgedacht und berücksichtigt. Die Fraunhofer-Institute IZI und IPA (Institut für Produktionstechnik und Automatisierung) bringen hierbei ihre Erfahrung im Bereich der GMP-Prozessentwicklung und der Entwicklung von Automatisierungslösungen für die Herstellung von Zelltherapeutika ein.

Ziel von REANIMA ist es, neue Therapien für die Herzregeneration bereitzustellen. Es ist europaweit das erste Projekt, das in diesem Bereich Ergebnisse aus der Grundlagenforschung einbezieht, um diese in die medizinische Anwendung zu überführen. Das in Tiermodellen gewonnene Wissen soll umfassend analysiert werden, um so neue regenerative Therapien zur Behandlung von Herzinsuffizienz zu entwickeln. Das Projekt wird im EU-Programm Horizon 2020 gefördert. Das Fraunhofer IZI gehört dem Projektkonsortium an, das insgesamt zwölf europäische Partner vereint.

Projektkoordination
Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC)

Grant Agreement No
874764

• www.reanima2020.eu

Zell- und Gentherapien sind innovative Behandlungsmethoden, die kurative Ansätze für schwere, bisher nicht heilbare Krankheiten ermöglichen. Dazu zählen Therapien mit genetisch modifizierten Zellen als Arzneimittel für neuartige Therapien (ATMPs). Bei CAR-T-Zelltherapien werden patient*inneneigene T-Zellen mit chimären Antigenrezeptoren (CAR) modifiziert. Zugelassene sowie die Mehrheit, der sich in Entwicklung befindlicher, neuer CAR-T-Zellen basieren auf der stabilen gen­technischen Modifizierung patient*inneneigener Zellen mittels viraler Vektoren. Da die CAR-T-Zelltherapie eine sehr junge Methode ist, sind die Langzeitfolgen noch wenig untersucht. Des Weiteren kommt es durch persistente CAR-T-Zellen teilweise zu starken Neben­wirkungen. Eine Alternative zur stabilen Veränderung ist die vorübergehende Modifi­kation von Zellen mittels einer für das CAR-Protein kodierenden Boten-RNA (mRNA).

Ziel der Kompetenzplattform ist die Entwicklung von transienten CAR-Zelltherapeutika für die Behandlung von immun-mediierten Erkrankungen. Dazu werden neue mRNA-Techniken und Nanotransporter-Systeme entwickelt. Auf diese Weise sollen in einem Etablierungsprojekt CAR-T-Zellen gegen aktivierte Fibroblasten generiert werden. Zur Funktionstestung kommen humane 3D-Zellkultur- und Gewebemodelle der Fibrose sowie eine neuartige Imaging-Plattform zum Einsatz. Weiteres Ziel ist der Transfer der Technologie auf Natürliche Killer (NK)-Zellen, um Spender-unabhängige CAR-Zelltherapien zu entwickeln.

Weiterhin werden mittels der Plattform mRNA-basierte CAR-Zelltherapeutika entwickelt, die ein erhöhtes Sicherheitsprofil aufweisen. Damit entsteht ein transienter ATMP-Ansatz zur Behandlung von fibrotischen Erkrankungen. Um den zukünftigen Bedarf von CAR-Zelltherapien erfüllen zu können, wird der Übergang von autologen (patient*innen­eigenen) zu allogenen (spender*innenfremden) Produkten gefördert, so dass mit einem Produktbatch möglichst viele Patient*innen behandelt werden können.

Bei Erfolg des Etablierungsprojekts sollen in Zusammenarbeit mit dem Fraunhofer ITEM weitere Ex-vivo-Modelle von fibrotischen Geweben für die Testung der CAR-Zellen eingesetzt werden. Zugleich soll die Plattform mittelfristig um andere zelltherapeutische Wirkweisen (z. B. T-Zellrezeptor-modifizierte Zellen) sowie andere Zielindikationen (z. B. Arthrose) erweiterte werden.

Die Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung (Graft-versus-host disease, GvHD) zählt mit einer Inzidenz von 30–40 Prozent zu den Haupt­komplikationen nach allogener hämatopoetischer Zelltransplantation. Herkömmliche Behandlungsmethoden zielen auf eine unspezifische Unter­drückung des gesamten Immunsystems ab, was das Risiko für Infektionen und Rezidive signifikant erhöhen kann. Zudem können die zu erwartenden Langzeiterfolge gering und sowohl mit hepato- als auch nephrotoxischen Neben­wirkungen vergesellschaftet sein. Das macht die Entwicklung weniger belastender Therapie­alternativen dringend notwendig.

Die Abteilung Zell- und Gentherapieentwicklung erarbeitet Protokolle und Verfahren, um die Herstellung des ATMPs (Arznei­mittel für neuartige Therapien) Palintra® zur Prävention der GvHD unter GMP-Bedingungen vorzubereiten. Durch Vorinkubation eines hämatopoetischen Zelltransplantats mit einem anti-humanen CD4-Antikörper werden unerwünschte Immunreaktionen gegen das Empfängergewebe nach Transplantation reduziert. Der anti-Tumoreffekt (GvL-Effekt), der vor der Entstehung eines Rezidivs schützt, bleibt jedoch erhalten. 

Als Teil der präklinischen Entwicklungs­phase wurden zellbasierte funktionelle Assays etabliert, welche erstmalig die Funktion dieses Immuntoleranz-induzierenden, anti-humanen CD4-Antikörpers in vitro messen können (Potency Assays). Mittels Next Generation Sequencing sollen zudem Veränderungen im Transkriptom von T-Zellen aufgedeckt und daraus der molekulare Wirkmechanismus des Antikörpers abgeleitet werden. Zusätzlich wird die Behandlungseffizienz von Palintra® zur GvHD-Prävention in vivo untersucht und mit konventionellen Therapien verglichen. 

Neben der Erfüllung präklinischer, behördlicher Auflagen sind aus den aufgeführten Experimenten neue Erkenntnisse bzgl. immuno­logischer Prozesse in der Induktion von Immuntoleranz und bzgl. der GvHD möglich. Die Modelle und Erkenntnisse sind nicht nur für die hämatopoetische Zelltransplantation, z. B. zur Leukämiebehandlung, sondern auch für die Stammzelltransplantation bei anderen Indikationen (z. B. Autoimmun­erkrankungen) von hohem Wert.

Zell- und Gentherapeutika, sogenannte Arzneimittel für neuartige Therapien (ATMP), besitzen ein sehr großes therapeutisches Potenzial. In der Hämatologie und Onkologie kommt beispielsweise die CAR-T-Zelltherapie seit 2018 in Deutschland zum Einsatz. Komplexe Logistikprozesse aus zentralen Produktionsstätten sowie unflexible Herstellungs- und Anwendungsschemata machen die Herstellung dieser Zelltherapeutika jedoch sehr zeit- und kostenintensiv. Im EU-Projekt »AIDPATH« (Artificial Intelligence-driven, Decentralized Production for Advanced Therapies in the Hospital) arbeiten Projektpartner aus Industrie und Forschung nun an der Entwicklung einer automatisierten und intelligenten Anlage, die in der Lage ist, eine zielgerichtete und patient*innenspezifische Zelltherapie direkt am Behandlungsort, also im Krankenhaus herzustellen. Zusätzlich befasst sich das Projekt mit der Integration der Anlage in das Krankenhausumfeld und berücksichtigt dabei Logistikprozesse sowie das Datenmanagement und die Datensicherheit.

Das Fraunhofer IZI bringt in das Vorhaben sein Know-how insbesondere in der Automatisierung der Herstellungsprozesse und der Anlagenvernetzung ein. Der Hauptstandort Leipzig ist schon seit längerem eine zentrale Herstellungs- und Entwicklungsstätte für ein CAR-T-Zelltherapeutikum, das zur Behandlung bestimmter Formen von Blutkrebs verwendet wird.

Das im Januar 2021 gestartete Projekt »AIDPATH« wird unter dem Förderkennzeichen 101016909 für vier Jahre im Rahmenprogramm der Europäischen Union für Forschung und Innovation Horizon 2020 gefördert.

Genetisch modifizierte Immunzellen sind dabei die Krebs­medizin zu revolutionieren. Insbesondere die CAR-T-­Zelltherapie hat sich in den vergangenen Jahren (seit 2017 / 2018) als wertvolle Option zur Behandlung bestimmter Formen von Leukämie und Lymphomen etabliert. 

Bei allen bislang zugelassenen CAR-T-Zellprodukten erfolgt die genetische Modifikation der Immunzellen mittels veränderter Viren. Diese werden als Transportvehikel genutzt, um die Gene für den therapeutisch relevanten CAR-Rezeptor dauerhaft in das Genom der Zielzelle zu integrieren.

Um diese Technologie weiterzuentwickeln, evaluieren Forschende des Fraunhofer IZI alternative Methoden zur genetischen Modifizierung von Immunzellen. Ziel ist die Erhöhung von Sicherheit und Effizienz der Therapie sowie die Erschließung weiterer Anwendungsgebiete zum Beispiel im Bereich der Autoimmunerkrankungen.

Der direkte Transfer von Boten-RNA (mRNA), als Vorlage zur Produktion therapeutischer Eiweißmoleküle in Zielzellen, ist eine der vielversprechendsten Alternative zur viralen Gen­modifikation. Die größte Hürde für eine klinische Anwendung liegt dabei in dem Transport der mRNA zum Wirkort im Körper. Um dieser Herausforderung zu begegnen, wurde die Lieferung von mRNA mittels Nanocarrier optimiert, die so stabil »verpackte« mRNA sicher und effizient in die Zielzellen einzuschleusen. Im Zellinneren wird die mRNA freigesetzt und die Produktion der therapeutischen Moleküle begonnen. 

Neben der Funktionalität und der optimalen Zusammen­setzung wurden auch erste sicherheitsrelevante Unter­suchungen auf Toxizität durchgeführt. Die erzielten Ergebnisse dienen nun als Basis für den nächsten Entwicklungsschritt, einer Proof-of-Concept Studie und Sicherheitsbewertung im Tiermodell. Das Projekt wird vom Bundesministerium für Bildung und Forschung gefördert.

Partner
Fraunhofer-Zentrum für Angewandte Nanotechnologie CAN

Die Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung (Graft-versus-Host Disease, GvHD) zählt mit einer Inzidenz von 30–60 Prozent zu den Hauptkomplikationen nach allogener hämatopoetischer Zelltransplantation. Herkömmliche Behandlungsmethoden zielen auf eine unspezifische Unterdrückung des Immun­systems ab, was das Risiko für Infektionen und Rezidive signifikant erhöhen kann. Umso wichtiger sind die Entwicklung neuer Wirkstoffe und Therapieansätze, die im besten Fall die Immunsystemfunktion der Patient*innen erhalten und Nebenwirkungen vermindern.

Seit einigen Jahren stehen Extrazelluläre Vesikel (EV) im Fokus verschiedener Forschungsansätze bei immun­vermittelten entzündlichen Erkrankungen. Neben verschiedenen diagnostischen Anwendungen stehen insbesondere entzündungs­hemmende und immunmodulierende Effekte im Interesse der Forschung. Nahezu jede Zelle sezerniert EV und eine Vielzahl an Zellen nimmt diese wieder auf. Sie spielen dadurch eine elementare Rolle in der interzellulären Kommuni­kation und übernehmen beim Erhalt des physiologischen Gleichgewichts sowie bei der Pathogenese verschiedener Erkrankungen eine wichtige Rolle.

Die Vesikel, mit einer Größe von etwa 50 bis 2000 nm, transportieren eine Fülle an Biomolekülen (unter anderem Proteine, Nukleinsäuren, Lipide, Metabolite). In verschiedenen In-vitro- und In-vivo-Studien konnten immunregulierende Effekte beispiels­weise durch EV aus Stammzellen beobachtet werden.

Im Auftrag der Lysatpharma GmbH (Eisenberg), welche ihren technologischen Schwerpunkt im Bereich der regenerativen Medizin und der Entwicklung von neuartigen Immun­therapien auf Basis von EV hat, evaluiert das Fraunhofer IZI das präven­tive und therapeutische Potenzial von EV in einem GvHD In-vivo-Modell (Maus). Die Lysatpharma GmbH wurde bei ihrer präklinischen Forschung und Produktentwicklung mittels einzel­betrieblicher Wirtschaftsförderung des Freistaats Thüringen (Projektnummer 2019 FE 0152 (EFRE)) unterstützt.

Die Einführung der CAR-T-Zelltherapie zur Behandlung verschiedener Krebserkrankungen markierte einen wichtigen Meilenstein für den Einsatz von zellulärer Immuntherapien in der Onkologie. 

Neben großen Hoffnungen, dass diese vielversprechende Therapie­form möglichst schnell für unterschiedlichste Krebsarten verfügbar wird, sind mit zunehmenden Patientenzahlen auch diverse Herausforderungen assoziiert. Hierzu zählt, dass CAR-T Zellprodukte patientenindividuell und in einem Aufwändigen Herstellungsprozess produziert werden müssen. Eine begrenzte Verfügbarkeit und hohe Therapiekosten sind die Folge.

Neben optimierten Herstellungsprozessen, stehen deshalb auch alternative Immuntherapien im Fokus internationaler Forschungsbemühungen.

Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) gelten als vielversprechende Ressource, um Kosteneffizienz und Verfügbarkeit von Krebsimmuntherapien zu optimieren. Nach dem gleichen Prinzip genetisch modifiziert wie CAR-T-Zellen, werden CAR-NK Zellen in die Lage versetzt Tumorzellen zu erkennen und gezielt zu zerstören. Im Gegensatz zu T-Zellen, sind NK-Zellen nicht immunogen. Sie können demnach auch von gesunden Spendern auf Patienten übertragen werden, ohne immunologische Abstoßungsreaktionen hervorzurufen. NK- und auch CAR-NK-Zellprodukte können somit kosteneffizienter und in größerem Maßstab produziert werden.

Im Auftrag der Affimed GmbH (Mannheim), wurde am Fraunhofer IZI das Potenzial einer Kombinationstherapie aus NK-Zellprodukten und sogenannten Innate Cell Engagern (ICE) untersucht. 

Diese ICE-Moleküle binden sowohl an NK-Zellen als auch an Tumorzellen, indem sie an den CD16A-Rezeptor auf den Immunzellen und ein spezifisches Antigen (CD19) auf den Tumorzellen binden. Sobald diese Brücke hergestellt ist, wird die Immunzelle aktiviert und zerstört die Tumorzelle.

Im Rahmen dieses Projektes wurde die antitumorale Wirksamkeit zweier Kombinationstherapien (NK-Zellen und CAR-NK-Zellen jeweils mit ICE kombiniert) im Vergleich zur einfachen CAR-NK-Zelltherapie in verschiedenen in vitro Experimenten untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass das zyto­toxische Potenzial der Kombinationstherapie der einfachen Therapie überlegen ist. Ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Kombinationen (NK-Zelle + ICE vs. CAR-NK-Zelle + ICE) konnte hingegen nicht beobachtet werden. Die Verwendung von ICE in Kombination mit einer NK-Zelltherapie hat somit das Potenzial zu einer erfolgreichen Krebsimmuntherapie, was jedoch in weiterführenden präklinischen und klinischen Studien vertieft untersucht werden muss.

Bislang ist häufig keine Heilung für die Augenkrankheit Glaukom (Grüner Star) möglich, die im schlimmsten Fall zum Verlust der Sehkraft führen kann. Aktuell angewandte Behandlungen und chirurgische Methoden sind oft nicht effektiv, wenig erfolgreich und teilweise auch nicht gut verträglich. Deshalb sind neue Therapien für die ständig wachsende Zahl an Patient*innen mit grünem Star – insbesondere durch eine dauerhafte Senkung des Augen­innendrucks – notwendig. Dazu zielen innovative Moleküle hinsichtlich ihrer Wirksamkeit auf die Reduktion der Augenhypertonie und somit zur Reduktion des Verlustes der Sehkraft.

Das Unternehmen Mannin Inc. hat ein neues rekombinantes Protein (Ang1 mimetic) entwickelt, das für die Therapie des Glaukoms zum Einsatz kommen soll. Es handelt sich dabei um einen spezifischen und potenten Aktivator der Tie2-Rezeptortyrosinkinase. Die Behandlung mit Ang1 mimetic soll bei Glaukom-Patient*innen den Flüssigkeitsabfluss aus dem Auge erhöhen und somit zu einer Reduktion des Augeninnendrucks führen. Dadurch kann die fortschreitende Schädigung der retinalen Ganglionzellen aufgehalten werden, was zur Heilung des grünen Stars führen würde.

Im Zusammenhang mit Entzündungen und Infektionskrankheiten wie COVID-19 (verursacht durch eine SARS-CoV-2-Infektion) ist die Tie2-Aktivierung wichtig bei der Aufrecht­erhaltung der Endothelfunktion und der vaskulären Barriere. Defekte in vaskulären Endothelzellen, bedingt durch Apoptose, Quieszenz oder weitere biologische Prozesse, resultieren in vaskulärer Durchlässigkeit und einer damit verbundenen Pathologie wie akuter respiratorischer Luftnot (ARDS, Acute Respiratory Distress Syndrome). Viele aktuelle Therapien für COVID-19 und ähnliche Infektionskrankheiten fokussieren auf antivirale Ansätze. Die Nutzung des neuen rekombinanten Proteins stellt einen Wirt-assoziierten Ansatz dar und zielt auf eine Stabilisierung des Endothels ab, was die Auswirkung von ARDS reduzieren würde.

Ziel des Projekts ist es daher, einen GMP-konformen Herstellungsprozess (konkret Zelllinien, Masterzellbänke, Upstream- und Downstream-Prozessentwicklung) des Fusionsproteins Ang1 mimetic einschließlich der notwendigen Qualitätskontrollen am Fraunhofer IZI zu etablieren, um eine klinische Anwendung des Biomoleküls zu ermöglichen.