Molekulare Biotechnologie

Die Arbeitsgruppe Molekulare Biotechnologie entwickelt und etabliert zelluläre und molekularbiologische Analyse- und Modellsysteme. Dabei kommen zellbasierte Assays, Gen­expressionsanalysen, immunologische und protein­chemische Methoden, komplexe Zellkulturmodelle sowie tierexperimen­telle Ansätze zum Einsatz. Die Arbeitsgruppe führt eine Reihe von zellbasierten Tests zur Substanz­charakterisierung bezüglich Effektivität, Toxikologie und Transport durch. Zum Leistungsspektrum gehört zudem die Etablierung neuer Tiermodelle, die auf die Untersuchung von Enzymfunktionen im Organismus abzielen.

Pathogenität von Superantigenen codiert von humanen endogenen Retroviren

Kooperationspartner: Klinik für Neurologie, Universitätsklinikum der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

Das Projekt basiert auf der Hypothese, das humane endogene Retroviren (HERVs) einen bedeutenden Beitrag für die langsam progrediente Neurodegeneration in Patienten mit Multipler Sklerose (MS) leisten. Die Erkrankung ist im Allgemeinen durch eine Demyelinierung in der weißen Substanz, inflammatorische Infiltrate, Astrogliose und frühe axonale Schädigungen aber auch durch Neuronenverlust und Läsionen in der grauen Substanz charakterisiert.

Die Ursachen von MS sind bisher wenig verstanden. Es wird u.a. eine anti-Myelin autoantigen-getriebene Autoimmunpathogenese vorgeschlagen. Diese Annahme wird aber durch eine Reihe klinischer Beobachtungen in Frage gestellt. So sind Veränderungen in der weißen Substanz bereits 3 Monate vor der Infiltration von Immunzellen zu beobachten. Des Weiteren haben Krankheitsschübe keinen Einfluss auf eine spätere Behinderung der Individuen. Die Standardtherapie durch Immunmodulation /-suppression hat weiterhin keinen Einfluss auf den Krankheitsverlauf von primär und sekundär progredienter MS. Die Erkrankung besteht also aus 2 separaten Armen, 1. einem inflammatorischen Anteil (Schübe) und 2. einer langsam progredienten Neurodegeneration. Für den wenig verstandenen 2. Arm könnte die Expression von endogenen Retroviren verantwortlich sein. Diese codieren für virale Hüllproteine, welche superantigene Eigenschaften aufweisen und somit zu einer starken Stimulation des Immunsystems beitragen.

Im Rahmen dieses Projektes werden die superantigenen Eigenschaften verschiedener HERVs untersucht und humanisierte monoklonale Antikörper gegen entsprechende Hüllproteine entwickelt.

Neue humanisierte Tiermodelle der Pathologie des Morbus Alzheimer

Die Alzheimersche Erkrankung ist durch einen fortschreitenden Neuronenverlust und damit verbunden einer Beeinträchtigung der kognitiven Leitungsfähigkeit charakterisiert. Trotz großer wissenschaftlicher Anstrengungen ist es noch nicht gelungen, die Pathogenese des Menschen in einem Tiermodell vollständig abzubilden. Verschiedene etablierte Tiermodelle, vor allem in der Maus, zeigen immer nur Teilaspekte der Alzheimer-Pathologie. Diese Pathologie basiert immer auf der Überexpression von Alzheimer-verwandten Genen, häufig inklusive seltener Mutationen, welche im sporadischen Alzheimer, der ca. 99% aller Erkrankungen ausmacht, nicht vorkommen. Wir haben 4 wesentliche Proteine, die für die Entstehung von Morbus Alzheimer verantwortlich sind, ausgewählt und ersetzen die entsprechenden Mausgene mit humanen unveränderten orthologen Sequenzen. Die vollständige Humanisierung der Tiere an den ausgewählten Loci durch Kreuzungen bildet dann die Grundlage für die Testung neuartiger Wirkstoffe gegen die Alzheimersche Krankheit.

Kaninchen-Modell der in-Stent Restenose für die Wirkstoffforschung

© Foto Fraunhofer IZI

Atherosklerose ist die häufigste Ursache für arterielle Gefäßverschlüsse, was u.a. zur akuten Unterversorgung des Herzmuskels mit Sauerstoff führen kann (Myokardinfarkt). Zur Wiedereröffnung wird als Standardtherapie die perkutane transluminale Angioplastie (PTA) mit und ohne Stentapplikation durchgeführt. Allerdings kommt es in bis zu 30 Prozent der klinischen Fälle, durch eine überschießende Proliferation glatter Muskelzellen in Kombination mit Monozyteninvasion, zur Neointimabildung, die zu einem Wiederverschluss des Gefäßes führt. Wurde zuvor ein Stent appliziert, spricht man von In-Stent Restenose (ISR).

Die Arbeitsgruppe Molekulare Biotechnologie verfügt über ein etabliertes In-vivo-Modellsystem der ISR. Die Stentimplantation im atherosklerotischen Kaninchenmodell ist ein effektives Instrument zur Erforschung neuer Wirkstoffe sowie neuer Biomaterialien und Medizinprodukte.

Substanzcharakterisierung in vitro

Aktivierung eines GPCRs durch verschiedene Liganden
© Foto Fraunhofer IZI

Aktivierung eines GPCRs durch verschiedene Liganden

Effektivität

Zur Bewertung der Effektivität von neuen Wirkstoffen, werden diese an Zellkulturen getestet. Dabei kommen spezifische, auf das Zielprotein zugeschnittene, Tests zur Anwendung. Ziel ist die Selektion der potentesten Verbindungen.

Toxizitätsuntersuchung von 2 Verbindungen (A und B) an einer humanen Hepatozytenzelllinie
© Foto Fraunhofer IZI

Toxizitätsuntersuchung von 2 Verbindungen (A und B) an einer humanen Hepatozytenzelllinie.

Toxizität

Zytotoxische und proliferative Effekte neuer Wirkstoffe werden an permanenten Säugerzelllinien untersucht. Dafür stehen >100 verschiedene Säugerzelllinien zur Verfügung. Aufgrund ihrer übergeordneten Bedeutung für die Metabolisierung von Wirkstoffen wird die Toxizität unter anderem an permanenten humanen Hepatozyten getestet.

Apparenter Permeabilitätskoeffizient ausgewählter Verbindungen und Wirkstoffe
© Foto Fraunhofer IZI

Apparenter Permeabilitätskoeffizient ausgewählter Verbindungen und Wirkstoffe.

Transport

Zur Abschätzung der Bioverfügbarkeit im Tiermodell steht ein Zellkultur-Assay zur Untersuchung des Transports von kleinen Molekülen über eine epitheliale Barriere zur Verfügung. Das verwendete Zellmodell sind CaCo-2 Zellen, epitheliale Zellen eines humanen kolorektalen Adenokarzinoms. Die Analyse erfolgt mittels LC-MS. Der ermittelte apparente Permeabilitätskoeffizient (Papp) kann zur Abschätzung der Bioverfügbarkeit verwendet werden.

Zellkultur Iba1-positiver primärer muriner Mikrogliazellen
© Foto Fraunhofer IZI

Zellkultur Iba1-positiver primärer muriner Mikrogliazellen.

Zellkultur GFAP-positiver primärer muriner Gliazellen
© Foto Fraunhofer IZI

Zellkultur GFAP-positiver primärer muriner Gliazellen.

Primäre Zellmodelle

Die Arbeitsgruppe hat eine langjährige Expertise in experimenteller Forschung anhand von Primärkulturen des zentralen Nervensystems.

Phänotypisierung transgener Mausmodelle

8 x PhenoMaster-System (TSE Systems)
© Foto Fraunhofer IZI

8 x PhenoMaster-System (TSE Systems)

IntelliCage (NewBehavior) für automatisiertes Verhaltens-Screening in Gruppen
© Foto Fraunhofer IZI

IntelliCage (NewBehavior) für automatisiertes Verhaltens-Screening in Gruppen

Die Phänotypisierung transgener Mausmodelle erfolgt anhand des SHIRPA-Protokolls und ist unterteilt in Primär-, Sekundär- und Tertiär-Screen. Dafür steht eine umfangreiche Testbatterie zur Beurteilung der allgemeinen Tiergesundheit und spezifischer Funktionen, z.B. motorischer Koordination, Kognition und Emotionen zur Verfügung. Hauptaugenmerk liegt auf der automatisierten Beobachtung unter Minimierung des Kontaktes der Tiere mit dem Menschen.

Histologie

Hämatoxylin/Öl-Rot-Färbung eines Plaques in der Aorta eines arteriosklerotischen Kaninchens
© Foto Fraunhofer IZI

Hämatoxylin/Öl-Rot-Färbung eines Plaques in der Aorta eines arteriosklerotischen Kaninchens.

Thioflavin S-positive Ablagerungen (grün) im Hippocampus eines Alzheimer-Mausmodells
© Foto Fraunhofer IZI

Thioflavin S-positive Ablagerungen (grün) im Hippocampus eines Alzheimer-Mausmodells.

Zur Untersuchung krankheitsrelevanter Zustände stehen eine Reihe verschiedener histologischer Schnitt- und Färbetechniken zur Verfügung.

Pharmakologie

Konzentration eines Wirkstoffes in der Zirkulation nach oraler Gabe
© Foto Fraunhofer IZI

Konzentration eines Wirkstoffes in der Zirkulation nach oraler Gabe.

Die Bestimmung pharmakologischer Parameter von Wirkstoffen, u.a. Bioverfügbarkeit und Plasmahalbwertzeit, erfolgt an katheterisierten Ratten. Die Untersuchungen erfolgen nach ausführlicher Testung anhand von isolierten Zellkulturen und nach Erteilung einer entsprechenden tierexperimentellen Genehmigung durch örtliche Behörden. Zur Messung der Wirkstoffspiegel stehen LC-MS basierte Methoden zur Verfügung.

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