Next-Generation Diagnostics

Derzeit erkranken in Deutschland pro Jahr knapp 24 000 Menschen am malignen Melanom, dem schwarzen Hautkrebs, einem ausgesprochen aggressiven Tumor mit hohem Metastasierungspotenzial. Trotz moderner Therapieverfahren liegt die 10-Jahres-Überlebensrate von Patient*innen im metastasierten Stadium bei unter 20 Prozent.

Signifikante Behandlungserfolge des malignen Melanoms werden bislang mit Antikörpern (sog. Immun-Checkpoint-Inhibitoren) erzielt, die die Aktivität tumormaskierender Proteine hemmen, wodurch die körpereigene Immunreaktion gegen den Tumor reaktiviert wird. Die Mehrheit der Patient*innen (60 Prozent) spricht allerdings nicht auf diese Behandlungen an und die Rückfallquote ist hoch.

Die im hämato-onkologischen Bereich bereits etablierte CAR-T-Zelltherapie eröffnet mittlerweile auch neue Perspektiven bei der Behandlung solider Tumore wie dem malignen Melanom. Dabei werden die Immunzellen der Patient*innen mit einem künstlichen Rezeptor ausgestattet, der es den Immunzellen fortan ermöglicht, Krebszellen zu erkennen und gezielt zu eliminieren.

Mit dem Projekt KI-CARs wollen die Projektpartner für die Behandlung des malignen Melanoms zunächst anhand humaner Tumorproben neue Zielstrukturen definieren, um anschließend eine wirksame CAR-T-Zell-Therapie präklinisch zu entwickeln.

Am Fraunhofer IZI werden mittels moderner Sequenzierungstechnologien (Einzelzellsequenzierung und räumlicher Sequenzierung) zunächst potenzielle Zielstrukturen definiert. Dabei werden hochkomplexe Datensätze erhoben, die das dynamische Verhalten der Zellen widerspiegeln. In Zusammenarbeit mit der Universität Leipzig werden aus diesen Daten, u.a. mit Methoden der künstlichen Intelligenz und computergestützter Modellierung, wirksame interagierende Molekülpaare und konkrete Zielstrukturen identifiziert.

Am Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf werden für diese Zielstrukturen spezifische CAR-T Zellen auf der Basis einer RevCAR-T-Plattform entwickelt und anschließend präklinisch getestet. Im Gegensatz zu konventionellen CAR-T-Zellen können RevCAR-T-Zellen Tumorzellen nicht direkt erkennen. Sie benötigen dafür ein zusätzliches tumorspezifisches Targetmodul. Die Aktivität der RevCAR-T-Zellen kann über die Verfügbarkeit der Targetmodule gesteuert und somit Nebenwirkungen kontrolliert werden.

Partner
Universitätsklinikum Leipzig, Klinik und Poliklinik für Dermatologie, Venerologie und Allergologie; Universität Leipzig, Institut für Wirkstoffenticklung; Helmholtz Zentrum Dresden Rossendorf, Abteilung Radioimmunologie

SARS-CoV-2 Vollgenomsequenzierung gemäß Coronavirus-Surveillanceverordnung

Die weltweite Ausbreitung von SARS-CoV-2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus type 2) sowie neuer Virusvarianten mit mutmaßlich gesteigertem Infektionsrisiko, machen eine zeitnahe Bestimmung der aktuell zirkulierenden Virusstämme notwendig. Mit dem Ziel die Anzahl der SARS-CoV-2 Genomsequenzierungen in Deutschland zu erhöhen und damit die Ausbreitung dieser Viren, sowie das Auftreten neuer Varianten frühzeitig festzustellen, ist am 19. Januar 2021 die Corona­virus-Surveillanceverordnung (CorSurV) in Kraft getreten. Diese sieht vor, dass mindestens fünf Prozent aller positiv auf SARS-CoV-2 getesteten Proben der Sequenzierung zugeführt werden (zehn Prozent bei bundesweit weniger als 70 000 Neuinfektion in einer Woche). Um alle Daten an einer gemeinsamen Stelle zu sammeln, müssen zudem sämtliche gewonnenen Sequenzierdaten über die DESH-Plattform an das Robert Koch-Institut (RKI) übermittelt werden und die Befunde den zuständigen Gesundheitsämtern gemeldet werden.

Für die Durchführung einer Vollgenom­sequenzierung wird am Fraunhofer IZI ein Ansatz genutzt, bei dem das komplette Virusgenom zunächst abschnittsweise, mittels spezifischer PCR-Reaktionen, vervielfältigt wird. Anschließend werden diese Genomabschnitte mit probenspezifischen Barcodes sowie Sequenzieradaptern markiert. Dadurch können mehrere Proben parallel sequenziert werden, das heißt die Abfolge der Nuklein­säure-Basen jedes Virusgenoms wird ermittelt. Die resultierenden Sequenzrohdaten werden einer bioinformatischen Analyse unterzogen, bei der die Nukleinsäure­sequenzen der einzelnen Genomabschnitte den zugehörigen Proben zugeordnet und wieder zu einem vollständigen Virusgenom zusammengesetzt werden. Anschließend wird das sequenzierte Virus­genom mit dem Referenz­genom des ursprünglich in Wuhan aufgetretenen SARS-CoV-2-Stamms abgeglichen. Werden relevante Veränderungen im Vergleich zum Referenzgenom festgestellt, wird die neue Virus­sequenz gegen eine Datenbank abge­glichen, um zu bestimmen, um welche Virus­variante es sich handelt. Die Ergebnisse werden in einem Report zusammen­gestellt und an den jeweiligen Auftrag­geber (klinische Partner bzw. Diagnostik­labore) übermittelt, sowie die vollständigen Sequenzdaten auf elektronischem Weg an das RKI übertragen. 

Durch die Kenntnis der vorherrschenden Virusvarianten, verbunden mit dem Wissen über Zeitpunkt, Häufigkeit und Ort des Auftretens, können Veränderungen hinsichtlich Ausbreitungs­geschwindigkeit und Schwere der ausgelösten Erkrankung bestimmt werden und gegebenenfalls notwenige Maßnahmen durch die zuständigen Behörden eingeleitet werden.

Entwicklung neuartiger Biomarker für die Diagnose und Prognose des Prostatakarzinoms

Aufgrund der demographischen Entwicklung nehmen onkologische, chronisch-entzündliche und degenerative Erkrankungen stetig zu. Deren Therapie ist trotz einer wachsenden Zahl von Behandlungsoptionen oft unbefriedigend. Hier kann eine personalisierte Therapie grundlegende Fortschritte bringen. Voraussetzung dafür ist die präzise Bestimmung der molekularen Basis einer Erkrankung sowie die Vorhersage des individuellen Krankheitsverlaufs und Therapie­ansprechens. Seit der vollständigen Sequenzierung des menschlichen Genoms in 2001 eröffnet die Entschlüsselung krankheitsrelevanter Gene neue Optionen für die Entwicklung maßgeschneiderter Therapieansätze. Neben dem Nachweis von Veränderungen in den DNA-Mustern (zum Beispiel Mutationen), rückt zunehmend die Untersuchung der RNA-Expressionsmuster von Genen, mittels transkriptomweiter Sequenzierung in den Fokus.

Innerhalb des von der Fraunhofer-Zukunftsstiftung geförderten RIBOLUTION-Projekts wurden auf der Grundlage von transkriptomweiter (RNA-) Sequenzierung in Kombination mit Microarray-Analysen neue Biomarker für das Prostata­karzinom identifiziert. Dabei wurden sowohl Biomarker für die Diagnose der Erkrankung, als auch für die Prognose der Aggressivität des Karzinoms gefunden.

Für die Bestätigung und spätere Anwendung als diagnos­tische Biomarker, soll eine überschaubare Anzahl Biomarker mittels eines einfachen Tests nachgewiesen werden. Daher wurde ein Workflow für den Nachweis diagnostischer Biomarker im Urin, unter Anwendung der quantitativen Realtime-PCR (qPCR) entwickelt. Für die Optimierung erfolgte unter anderem eine ausführliche Testung geeigneter Referenz- und Zielregionen, der Primer und Sonden sowie eine Anpassung der Reaktionsbedingungen. Für die Auswertung wurden die ausgewählten Biomarker, in enger Kooperation mit der AG Bioinformatik, mittels eines eigens entwickelten Algorithmus untersucht.

Für die komplexere Fragestellung der Prognose, entwickelte die AG Analysestrategien einen Workflow, der auf RNA-Sequenzierung aus FFPE-Biopsiematerial beruht. Ziel war es, in klinisch verfügbaren Proben, ein breites Spektrum potenzieller Biomarker nachzuweisen. Im Sinne einer Zeit- und Kosten­reduktion erfolgte eine Optimierung der Sequenzierung hinsichtlich Sensitivität und Robustheit. Auf Grundlage dieses etablierten Vorgehens erfolgt aktuell die transkriptomweite Sequenzierung einer großen Patientenkohorte (n>150), zur Bestätigung der identifizierten Biomarker.

Die im Rahmen des Projekts entwickelten Workflows sollen zukünftig auf weitere Indikationen übertragen werden.

Ribolution

Das Projekt »RIBOLUTION – Integrierte Plattform für die Identifizierung und Validierung innovativer RNA-basierter Biomarker für die Personalisierte Medizin« ist ein von der Fraunhofer-Zukunftsstiftung geförderter Forschungsverbund. Das Projekt wird durch Prof. Dr. Friedemann Horn am Fraunhofer IZI koordiniert.

Im Projekt RIBOLUTION werden durch genomweite Screening-Verfahren neue RNA-Biomarker für komplexe Erkrankungen (beispielsweise onkologische, chronisch-entzündliche und degenerative Erkrankungen) identifiziert. Dabei erfasst RIBOLUTION auch sogenannte nichtkodierende RNAs, deren Bedeutung als potenzielle Biomarker erst in jüngster Vergangenheit erforscht wurde.

Im Anschluss an die Screening-Phase werden potenzielle Biomarker hinsichtlich ihrer diagnostischen und prognostischen Aussagekraft beurteilt. Interessant sind dabei solche Biomarker, die als diagnostische Indikatoren eine Erkrankung anzeigen oder ihren Verlauf bzw. das Ansprechen auf Therapien prognostizieren können.

Zusätzlich wird der Prozess des Biomarker-Screenings durch RIBOLUTION mit Hilfe technischer Innovationen optimiert und perfektioniert.