Antikörpertechnologien

Arbeitsmethoden

• Antigenpräparation und Proteinpräparation für die Immunisierung:
  • Spektroskopische Analyse der Immunisierungsproteine und Überführung in einen für die Immunisierung geeigneten Puffer
  • MS-Analyse des Antigens zur Qualitätsüberprüfung
  • Bei niedermolekularen Antigenen: kovalente Kopplung an entsprechende Trägerproteine (KLH, BSA)
• Analyse mittels Immunogenitätstests zur Abschätzung der allgemeinen Immunantwort in der Maus im Rahmen der Antikörpergenerierung 
• Immunisierung, Milzzellpräparation, Zellfusion
• Epitop-spezifische Serum-Titermessungen (mittels Enzyme linked immunosorbent Assay (ELISA) bzw. auf Wunsch auch durch Oberflächenplasmonenresonanz (SPR))

• Fusion isolierter muriner Milzzellen mit SP2/0-Ag14-Zellen zur Hybridomagenerierung
• Screeningverfahren (Standard ELISA, wenn gewünscht SPR) zur Isolation von Hybridomazellen, die spezifische Antikörper generieren
• Zusätzliche ELISA- bzw. SPR-Screenings zum Ausschluss von Kreuzreaktivitäten während der Vereinzelung der Hybridoma-Zellklone
• Qualitätskontrolle, zum Beispiel Mykoplasmentests
• Übergabe von Kryostocks an den Projektpartner oder Langzeitlagerung

• Kultivierung und Expansion antikörperproduzierender Hybridomazellen entsprechend der gewünschten Mengen an Antikörper
• Isolation der Antikörper aus dem Zellkulturüberstand, zum Beispiel mittels ProteinG/A-Affinitätschromatographie

• Charakterisierung monoklonaler Antikörper hinsichtlich ihres Bindungsverhaltens und der Affinität zum betrachteten Epitop mittels verschiedener Methoden, zum Beispiel Western Blot, ELISA und SPR
• Bestimmung der Subtypen / Isotypen der schweren und leichten Kette des Antikörperkandidaten
• Röntgenstrukturanalyse von Antikörper-Fab-Fragmenten zur zielorientierten Veränderung der AK-Epitop-Bindung:
  • Spaltung von Antikörpern zur Generierung des Fab-Fragments
  • Co-Kristallisation des Fab-Epitop-Komplexes mittels random matrix screening
  • Kristalloptimierung und Röntgenbeugungsanalyse
  • Strukturberechnung und Modellierung

• In-silico-Analyse variabler Domänen der schweren und leichten Kette des Maus-Antikörpers in Bezug auf die CDRs (Complementary Determining Region) und weiterer Aminosäure-Reste mit möglicher Beteiligung an der Antigenbindung (Vernier-Reste)
• Auswahl von entsprechenden humanen AK-Kandidaten zur zielgerichteten Übertragung der zuvor identifizierten Sequenzbereiche bzw. Aminosäuren (Grafting)
• Klonierung in Expressionsvektor für rekombinante Expression in eukaryotischen Zellsystemen und anschließender Proteinreinigung
• Austausch der Subtypen im Zuge der rekombinanten Expression
• Charakterisierung der Bindungseigenschaften im Vergleich zum parentalen Maus Antikörper durch verschiedene Methoden wie ELISA, SPR, Immunhistochemische Färbungen

• Entwicklung spezifischer enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) zur quantitativen Detektion des Analyten unter Verwendung von in house hergestellten oder vom Projektpartner zur Verfügung gestellten Antikörpern
• Bedarfsorientierte Funktionsprüfung des entwickelten ELISA: Von der einfachen Qualitätsüberprüfung bis hin zur GLP-konformen ELISA-Validierung in Übereinstimmung mit den geltenden Richtlinien der amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) und der europäischen Arzneimittelagentur (EMA)