Abteilung Präklinische Entwicklung und Validierung

Die CAR-T-Zelltherapie basiert auf dem Prinzip, Immunzellen (T-Zellen) durch genetische Modifikation mit einem chimären Antigenrezeptor (CAR) auszustatten. Dieser versetzt die Immunzellen in die Lage, spezifische Oberflächenstrukturen (Antigene) auf Krebs- oder anderen Zielzellen zu identifizieren und daraufhin eine entsprechende Immunantwort zu aktivieren. Bei den bislang zugelassenen Therapieverfahren werden die T-Zellen mittels viraler Vektoren genetisch modifiziert. Mit der ROR2-CAR-T-Zelltherapie entwickelten Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler des Universitätsklinikums Würzburg eine Immuntherapie, die sich sowohl in der Art der genetischen Modifikation, wie auch dem adressierten Zielantigen von den bisher zugelassenen Therapien unterscheidet. Diese soll, im Rahmen eines vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) geförderten Projektes, in die klinische Anwendung überführt werden. Das ROR2-Protein ist ein Transmembranrezeptor, der vor allem während der Embryonalentwicklung eine wichtige Rolle spielt. Es wird normalerweise nicht oder nur geringfügig auf nicht-malignen Zellen exprimiert. Bei einigen Krebsarten, darunter das Multiple Myelom und das klarzellige Nierenzellkarzinom, kommt es zu einer Überexpression auf den betreffenden Krebszellen. Dies macht das Antigen zu einem geeigneten Ziel für entsprechend ausgerichtete CAR-T-Zellen. In diesem Projekt kommt ein neues Verfahren zur Herstellung autologer CAR-T-Zellen zum Einsatz. Die genetische Modifikation der patienteneigenen T-Zellen erfolgt hierbei über einen nicht-viralen Gentransfer, durch den, verglichen zum viralen Gentransfer, ein einfacherer, skalierbarerer und damit preiswerterer Herstellungsprozess ermöglicht werden kann. Der chimäre Antigenrezeptor wurde so konstruiert, dass er zusätzlich zur T-Zellaktivierung auch die Überexpression des Transkriptionsfaktors Batf3 initiiert, um die Persistenz der T-Zellen und die tumorizide Wirkung zu verbessern. Das Fraunhofer IZI verantwortet zwei Schwerpunkte innerhalb des Projektes, (1) die präklinische Prüfung der Unbedenklichkeit und Wirksamkeit des neuartigen CAR-T-Zellproduktes, einschließlich der Ermittlung der Expression des Zielmoleküls ROR2 in gesunden Geweben und der Identifizierung potenzieller kreuzreagierender Epitope (Tissue Cross-Reactivity GLP-Studie) und (2) die pharmazeutische Herstellung der klinischen Prüfpräparate für die klinische Studie, inklusive der vorherigen Etablierung und Validierung des Herstellungsprozesses sowie der sicherheitsrelevanten Qualitätskontrollen. Die multizentrische klinische Studie (Phase I, first-in-human) wird an den Universitätskliniken Würzburg, Regensburg und Leipzig realisiert. 

In diesem Projekt liegt der Fokus auf der Entwicklung und Etablierung eines humanisierten Mausmodells (huNSG; huNOG) zur Gewinnung neuartiger, voll humaner monoklonaler Antikörper, die zur Therapie von Tumorerkrankungen (Pilotprojekt: Dreifach-negatives Mammakarzinom) eingesetzt werden sollen. Hierbei kommen immundefiziente NSG- oder NOG-Mäuse zum Einsatz, die nach Transfusion humaner hämatopoetischer Stammzellen aus Nabelschnurblut ein humanisiertes Immunsystem ausgebildet haben. Durch gezielte Beeinflussung des Engraftments soll die Entwicklung tumorspezifischer B- und T-Zellen gefördert werden. Parallel dazu werden den Mäusen, die ein humanisiertes Immunsystem ausgebildet haben, Tumorzellen von Zelllinien (CDX) oder Patient*innenmaterial (PDX) transplantiert oder sie werden mit einem bekannten tumorspezifischen oder tumorassoziierten Antigen immunisiert. Zur Generierung tumorspezifischer, komplett humaner monoklonalen Antikörper, werden die B-Zellen isoliert und mit humanen Plasmozytomzellen fusioniert. Potenzielle Antikörperkandidaten werden zunächst in vitro in einer 2D- und 3D-Zellkultur auf ihr Internalisierungs- und Metastasierungsverhalten, sowie auf eine mögliche Komplement- und / oder NK-Zell-Aktivierung getestet (durchflusszytometrische Analysen; Echtzeitzellanalysen (xCELLigence®RTCA) und Lebendzell-Mikroskopie). Die Antikörper, die in vitro die besten Ergebnisse zeigen, werden weiter in präklinischen Studien (GLP-analog) im humanisierten Tumor-Xenotransplantat-Mausmodell (PDX) auf ihre Wirksamkeit geprüft und ggf. für den klinischen Einsatz optimiert zum Beispiel als Antibody Drug Conjugate (ADC), Antibody Cytokine Conjugate (ACC) oder bispezifische Antikörper. In einem Kooperationsprojekt mit der Universität Regensburg konnte gezeigt werden, dass sich nach Ko-Transplantation von humanen hämatopoetischen Stammzellen aus der Nabelschnur und humanen Brustkrebszelllinien humane tumorspezifische IgM- und IgG-Antikörper in den humanisierten Mäusen bilden, die im Serum nachgewiesen werden können.

Förderung: EFP

Im Rahmen eines, vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) geförderten Verbundprojektes, wird ein kombiniertes Wirkstoffpräparat zur Schmerzlinderung in präklinischen Studien untersucht. Ziel ist es Sicherheitsrisiken vor der erstmaligen Anwendung in Patient*innen zu minimieren. Das Projekt NANOpain beruht auf einer Kombination aus einem bereits zugelassenen Opioid (vorzugsweise kappa-Rezeptor Agonisten) und eines dendritischen Nanotransportmoleküls (Nanocarrier). Nach dem EPR Effekt ("enhanced permeability and retention effect") lagern sich die dendritischen Moleküle bevorzugt im entzündeten und tumorösen Gewebe an, sodass eine gezielte Lokalisation und eine Verringerung von Nebenwirkungen wie Sucht, Aversion und Verstopfung erreicht werden können. Die Wirksamkeit wurde bereits seitens der DendroPharm GmbH sowohl in vitro als auch in vivo getestet. Am Fraunhofer IZI werden die sicherheitsrelevanten präklinischen Untersuchungen in entsprechenden Tiermodellen (Kleintiermodell, Großtiermodell) unter GLP-Bedingungen durchgeführt. Zunächst erfolgt eine Pharmakodynamik/Pharmakokinetikstudie im Tiermodell, um den Abbau des Wirkstoffes in Abhängigkeit der Zeit zu untersuchen. Die toxikologischen Überprüfungen des Wirkstoffpräparates werden anschließend sowohl in einem Mausmodell als auch in einem Minischweinmodell umgesetzt. Zusammen mit der Herstellung des Prüfpräparats unter GMP-Bedingungen durch die DendroPharm GmbH wird so die Voraussetzung geschaffen, um das entwickelte Arzneimittel anschließend am Fraunhofer-Institut für Toxikologie und Experimentelle Medizin in einer klinischen Phase-I-Studie zu untersuchen.

Die Bezeichnung chronisch-entzündliche Darmerkrankungen (CED) umfasst Krankheitsbilder, die durch schubweise oder kontinuierlich auftretende, entzündliche Veränderungen des Darmepithels charakterisiert sind. Die wichtigsten CED sind Morbus Crohn und Colitis ulcerosa. In Deutschland gibt es ca. 300 000 Betroffene, mit jahrelangen Beschwerden wie Bauchschmerzen, Durchfällen, Abgeschlagenheit, Augen- u. Gelenkentzündungen sowie psychischen Beeinträchtigungen. Die genaue Ursache für CED ist unbekannt. Genetische Faktoren wie auch Umwelteinflüsse sind beteiligt und induzieren die Zerstörung der Homöostase an der Darmepithelbarriere sowie die chronische Aktivierung des lokalen Immunsystems durch mikrobielle Komponenten. Trotz großer Anstrengungen zur Entwicklung neuer CED-Therapieansätze sind bislang nur symptombezogene nicht aber kausale, kurative Therapien in Sicht. Neuere Studien zeigen, dass der Arylhydrocarbon-Rezeptor (AhR) einen Ansatz für eine kausale Therapie bieten könnte.

Deshalb wurden mithilfe von Repurposing-Bibliotheken AhR-Liganden identifiziert, die bereits in präklinischen und klinischen Studien für andere Indikationen als unbedenklich eingestuft wurden. Ausgewählte Kandidaten wurden zunächst in einfachen In-vitro-Modellen mit Knochenmarksmakrophagen aus der Maus auf die Induktion anti-inflammatorischer Effekte (Interleukin(IL)-10-Induktion, IL-1-Suppression) hin untersucht. Anschließend wurden geeignete Kandidaten in komplexeren In-vitro-Modellen (Transwell®- und Organoid-Modelle auf Basis von humanen Darmepithelzellen) getestet Die wesentlichen Testparameter waren hierbei die Induktion bestimmter Tight-junction-Proteine und Zytokinrezeptoren. In dieser Teststufe sind vier Kandidaten als aussichtsreich für die weitere Wirkstoffentwicklung identifiziert worden, wovon bereits zwei Kandidaten in zwei verschiedenen In-vivo-Modellen (Natriumdextransulfat- und Bakterien-induzierte Kolitis in der Maus) geprüft worden sind. Da bei diesen beiden Kandidaten keine signifikante therapeutische Wirkung erzielt werden konnte, sind inzwischen zwei weitere Kandidaten in die In-vivo-Prüfung und ein zusätzlicher Kandidat in die zweite In-vitro-Teststufe einbezogen worden.

Projektpartner: Fraunhofer CIMD, Fraunhofer IIS, Fraunhofer ITMP, Fraunhofer ISC

Förderung: Fraunhofer CIMD

Menschliche Knochen haben die beachtliche Fähigkeit zu einer vollständigen Heilung. Dennoch können verschiedene Bedingungen dafür sorgen, dass die Heilung des Gewebes kompromittiert abläuft oder sogar ganz ausbleibt. Die Gründe dafür können eine zu schwer­wiegende Fraktur oder systemische Erkrankungen wie Osteoporose oder Typ-2 Diabetes mellitus sein. Im letztgenannten Fall, kommt es zu einem verschlechterten Ein­wachsen von Blutgefäßen sowie einer gestörten Differenzierung von knochen­bildenden Osteoblasten. Das Ausmaß der Störung in den Heilungskapazitäten ist jedoch sehr individuell und bis heute gibt es keine diagnostische Methode, um diese vor Therapiebeginn zu erkennen. Dies erhöht das Leiden der Patient*innen in der Therapie, bevor dann mit dem Einsatz von Knochenimplantaten, die aus inerten Materialen bestehen oder als Eigenspende- oder Fremdspendegewebe eingesetzt werden, begonnen wird. Die bestehenden Materialien sind aus unterschiedlichen Gründen nicht ideal.

Hier setzt das SyMBoD-Projekt an, mit der Entwicklung einer digitalen Plattform zur Entscheidungshilfe in der Therapie von Knochenbrüchen von Patient*innen mit Typ-2 Diabetes mellitus. Ziel ist es (i) theranostische Biomarker zu identifizieren (ii) individualisierte, fraktur- und patientenspezifische Implantate zu modellieren. Dafür werden in verschiedenen Geweben (Blutplasma und -zellen, Knochengewebe und Exosomen) sowohl in Tierversuchen als auch aus humanen Biobanken multi-OMICS Verfahren angewendet, die individuelle molekulare Profile aufdecken werden. Diese zeitaufgelösten Profile werden mittels KI-gestützter bioinformatischen Methoden zu klinischen Parametern und Heilungsverläufen korreliert und werden eine Gruppierung von Patient*innen in Risikogruppen und die Identifizierung von Biomarkern ermöglichen.

Parallel werden durch iterative Testung in Tiermodellen bioresorbierbare Polycaprolacton-basierte Gerüstkonstruktionen optimiert. Hier kommen multiskalierte Modellierungen zum Einsatz, um die biomechanischen Eigenschaften auf unterschiedlichen Größenskalen zu optimieren und Computermodelle von bestmöglichen patienten- und frakturspezifischen Implantaten zu erstellen.

Sowohl molekulare als biomechanische Modelle werden in die Plattform integriert und werden Klinikern ermöglichen (i) Risikopatient*innen anhand ausgewählter Biomarker zu identifizieren und (ii) nahtlos Computermodelle von Gerüstkonstruktionen anhand Bildaufnahmen zu erstellen. Diese Modelle können dann im CAD-CAM-3D-Druckverfahren unter GMP-Bedingungen aus bioresorbierbaren Materialien zu individualisierten Knochenimplantaten umgesetzt werden.

Weltweit sind Millionen Menschen von chronischen Krankheiten betroffen, die ursächlich zu 70 % aller verzeichneten Todesfälle beitragen. Betroffene Patient*innen erhalten häufig über Jahre hinweg wiederkehrende medikamentöse Behandlungen, die die Krankheiten nur symptomatisch behandeln, zunehmend Nebenwirkungen auslösen und somit auch zu psychischen Belastungen führen. In einer immer älter werdenden Bevölkerung stellen chronische Erkrankungen die Gesellschaft vor zunehmende sozioökonomische Herausforderungen.

Das ISOS-Konsortium zielt auf die Entwicklung des ersten biomedizinischen Produkts für die In-situ-Herstellung und die selbsttätige Verabreichung von therapeutischen Wirkstoffen ab. Grundlage für dieses Produkt stellen probiotische gentechnisch veränderter Bakterien (GVB) dar, die die therapeutischen Moleküle "auf Abruf", stimuliert durch die Signale des pathologischen Umfelds im Patienten, produzieren. Eingebettet werden die GVB in einen auf Biomaterialien basierenden Bioreaktor, der die Vitalität der Bakterien aufrechterhält und die Freisetzung des biologisch hergestellten Wirkstoffes kontrolliert. Dieses GVB-Ökosystem soll so konzipiert sein, dass Bakterien außerhalb des einkapselnden Biomaterials nicht überleben können, um künftigen Anforderungen an die biologische Sicherheit und den gesetzlichen Vorschriften gerecht zu werden.

Als Proof-of-Concept arbeitet das ISOS-Konsortium an der Entwicklung eines implantierbaren Bioreaktors auf GVB-Basis für die Therapie der feuchten Form der altersbedingten Makuladegeneration (AMD). Diese ist gekennzeichnet durch das krankhafte Wachstum von Blutgefäßen in die Netzhaut, hervorgerufen durch eine abnorme Produktion des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF). Die einzige Behandlungsform ist derzeit die wiederholten intraokularen Injektionen von Anti-VEGF-Antikörpern, die Patient*innen häufig vor psychischen Herausforderungen stellt. Innerhalb des ISOS-Projektes sollen über computergestützte Modelle VEGF-neutralisierende Peptide und Nanobodies vorhergesagt und experimentell bestätigt werden. Anschließend werden probiotische Bakterien gentechnisch designt diese Anti-VEGF-Moleküle zu produzieren und eingebettet als GVB-Bioreaktor intraokular implantiert. Diese einzige Implantierung und kontinuierliche Produktion von VEGF-neutralisierenden Molekülen hat das Potential, die wiederholten Injektionen von Anti-VEGF-Antikörpern zu ersetzen.

Die beteiligten Wissenschafler*innen am Fraunhofer IZI sind dabei maßgeblich an der experimentellen Bestätigung und Charakterisierung der Interaktion von hervorgesagten anti-VEGF-Molekülen zu VEGF beteiligt. Dabei werden die Bindungskinetiken, mittleren inhibitorische Konzentrationen und molekularen Bindungsstellen bestimmt, um finale Moleküle aus einer Kandidatenbibliothek auszuwählen. Im Projekt kommen Methoden zur Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie, in vitro Bioassays und HDX-Massenspektrometrie zum Einsatz. In einer zweiten Projektphase erfolgt die nanoLC-MS-basierte proteomische Charakterisierung transformierter Bakterien zur Bestätigung der kontinuierlichen Sekretion der anti-VEGF-Moleküle und Vitalität der Bakterien.

• Entwicklung einer Fertigungsplattform für die 3D-Druck-Herstellung resorbierbarer Implantante zur vollständigen Regeneration von Sehnen und Bändern (Liga-Forte)
• Entwicklung von Diagnostiktests zur Bestimmung von Biomarkern in Milch und Blut zur Gesundheitsüberwachung in Milchviehbeständen  (On-Farm-Recording_Breeding)
• GLP-konforme Prüfung eines allogenen, Matrix-assoziierten Zelltransplantates aus mesenchymalen Stromazellen des Nabelschnurgewebes
• GLP-Studie zur Beurteilung der systemischen Toxizität und der Immuntoxizität einer therapeutischen HBV-Vakzine (TherVacB)
• LowAllergen / FoodAllergen – Nachweis von pflanzlichen allergenen Proteinstrukturen mit anschließender Modifikation und der Testung der erfolgreichen Allergenreduktion durch analytische Methoden
• Präklinische GLP-Studie zur Sicherheitsprüfung einer auf den Receptor Tyrosine Kinase-Like Orphan Receptor 1 (ROR1) gerichteten CAR-T-Zelltherapie im NSG-Mausmodell