Zellfreie Proteinsynthese

Die Arbeitsgruppe Zellfreie Proteinsynthese beschäftigt sich mit der Synthese rekombinanter Proteine in verschiedenen zellfreien Systemen. Ein besonderer Fokus liegt in der Charakterisierung, Modifizierung und Funktionsuntersuchung zellfrei hergestellter Antikörperformate. Um Proteine analysieren zu können, müssen diese zunächst in funktionell aktiver Form zur Verfügung gestellt werden. Die Expression von Proteinen in lebenden Zellen, also in vivo, wird vielfach angewendet, führt jedoch nicht immer zum erwünschten Ziel, da sich nicht jedes Protein in Zellkulturen zufriedenstellend synthetisieren lässt. Eine effiziente Alternative zur Expression von Proteinen in lebenden Zellen stellt die zellfreie Proteinsynthese dar. Hierbei werden die Inhaltsstoffe der Zelle genutzt, um ein bestimmtes Zielprotein auf schnelle und kostengünstige Weise herzustellen. Die Verwendung von eukaryotischen Zelllysaten bietet den besonderen Vorteil, dass sie die Synthese von Proteinen mit posttranslationalen Modifizierungen (PTMs) erlauben.

  • Herstellung, Optimierung und Klonierung von »ready-to-express« DNA-Templaten für die zellfreie Proteinsynthese
  • RNA-Synthese (Transkription, Analyse und Aufreinigung von mRNA)
  • Zellfreie Synthese und Charakterisierung rekombinanter Antikörperformate
  • Synthese rekombinanter Antikörperformate auf Basis linearer oder zirkulärer DNA-Template in eukaryotischen In-vitro-Transkriptions-Translationssystemen
  • Parallele Herstellung der Antikörperformate in verschiedenen Reaktionsführungen, z. B. im Batch- und Dialyse-Modus bzw. gekoppelt (Transkription und Translation in einem Reaktionssystem) und entkoppelt (Transkription und Translation in separaten Reaktionen)
  • Bestimmung der Syntheseausbeute mittels (14C)-Protein-Labeling und TCA-Präzipitation
  • Charakterisierung der Proteinexpression durch Gelelektrophorese, Autoradiographie und quantitatives Imaging im Phosphorimager
  • Protein-Analyse mittels Fluoreszenz-Mikroskopie und Western Blotting
  • Gerichtete Proteinevolution durch Mutagenese und Aktivitäts-Screening
  • Kotranslationale Markierung von Antikörperfragmenten, z. B. mit Fluoreszenzfarbstoffen
  • Funktionsuntersuchungen an zellfrei hergestellten Antikörperfragmenten z. B. durch ELISA
  • Optimierung von In-vitro-Translationssystemen zur Synthese Disulfid-verbrückter Proteine

Zellfreie Antikörpersynthese

Spezifische Antikörper sind sowohl in der Diagnostik als auch Therapeutik von unschätzbarem Wert, daher werden zellfreie Proteinsynthesesysteme auf Basis eukaryotischer Zellextrakte als neue Strategie zur effizienten und zuverlässigen Synthese und Selektion geeigneter Antikörperkandidaten genutzt. Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden der Generierung von Antikörperfragmenten kann damit eine enorme Zeitersparnis und Kosteneffizienz erzielt werden. Desweiteren bieten offene eukaryotische In-vitro-Translationssysteme großen Spielraum für Modifikationen zur Verbesserung der Qualität und Erweiterung der Eigenschaften zellfrei hergestellter Proteine. Ein pharmakologisch relevantes Potential ergibt sich zum Beispiel aus der zellfreien Synthese von Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten, die in vivo nicht synthetisiert werden können. Durch die Optimierung der biologischen Prozessabläufe in definierten Reaktionsumgebungen kann eine individuelle Adaption der Synthesebedingungen an die Erfordernisse des jeweiligen Proteins erfolgen. Auf diese Weise ist ein paralleles Expressions-Screening unterschiedlicher proteinkodierender Sequenzen ebenso möglich, wie das Austesten geeigneter Reaktionsparameter für ein definiertes Protein.

Zellkulturlabore der Sicherheitsklasse S1

  • 5 l Fermenter (Sartorius Biostat B DCU-II Advanced Additive Flow System; 2x 5 l Kessel, aufrüstbar mit bis zu 6 Gefäßen zwischen 1 und 10 l)
  • 30 l Fermenter (Sartorius Biostat D DCU)
  • konfokales Laserscanning-Mikroskop (Zeiss CLSM 510)
  • automatisierte Zellassay- und Screening-Einheit (PerkinElmer; CellLuxCellularFluorescence Workstation)

Isotopenlabor

  • Proteinmarkierung (Umgang mit 14C, 32P, 35S)
  • Absauganlage für die Abtrennung von 14C-markierten Proteinpräzipitaten (TCA-Präzipitation)
  • Szintillationszähler (Beckmann LS 6500 Multi Purpose Scintillation Counter)
  • Geltrocknungsanlage für Autoradiogramme (Unigeldryer 3545)
  • Typhoon Trio+ variable-mode-Imager (Radioaktivität, Fluoreszenz und Chemilumineszenz mit erweitertem 10 µm Pixel-Scan)

Labore der Sicherheitsklasse S1 für molekularbiologische Arbeiten

  • Multimode Reader Berthold LB 941 vi-S TriStar (Flash-, Glow- und Farb-Lumineszenz, Absorption, Fluoreszenz, FRET, BRET)
  • Sirius single tube Luminometer (Titertek Berthold)
  • Spektralphotometer für UV/Vis (Nanodrop ND-2000c)
  • Bioreaktoren für die zellfreie Proteinsynthese im Batchverfahren und im Dialysemaßstab

Massenspektrometrie in Laboren der Sicherheitsklasse S1

  • Massenspektrometer Q-TOF MaxIs Impact (Bruker Daltonics) mit austauschbaren Ionenquellen (offline nanoESI source, conventional ESI source, captive spray für die Nano-LC Kopplung)
  • Ultra-sensitive Ionenfalle AmaZon Speed ETD (Bruker Daltonics) mit austauschbaren Ionenquellen (conventional ESI source, captive spray für die Nano-LC Kopplung)
  • UHPLC Chromatographieanlagen, Ultimate 3000 nanoRSLC system (Dionex)

Analytik von Membranproteinen in Laboren der Sicherheitsklasse S1

  • Patch-Clamp System »Port-A-Patch« und Orbit 16 der Firma Nanion
  • Partikelanalyse mittels »Zetasizer Nano ZS« der Firma Malvern

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