Eukaryotische Lysate

Translationsaktive Lysate stellen die Grundlage für die Synthese von Proteinen in zellfreien Systemen dar. Für die Darstellung von posttranslational modifizierten Proteinen, wie z. B. Glykoproteine und membranständige Proteine, sind endogene Mikrosomen in eukaryotischen Lysaten essentiell, um eine korrekte Translokation in die Mikrosomenmembran zu gewährleisten. Die Arbeitsgruppe Eukaryotische Lysate bietet langjährige Erfahrung in der Kultivierung von eukaryotischen Zelllinien und deren Überführung in translationsaktive Lysate für die Synthese von Proteinen. Einen hohen Stellenwert nimmt die Austestung neuer Zelllinien auf ihre In-vitro-Expressionsfähigkeit ein. Die Entwicklung und stetige Weiteroptimierung von eukaryotischen zellfreien Translationssystemen ist ein wichtiger Forschungsbereich der Arbeitsgruppe. Hierbei ist der Einfluss von Fermentation, Zellaufschluss, aber auch der Transkriptions- und Translationskomponenten auf die Produktivität der Lysate von entscheidendem Interesse.

  • Fermentation von eukaryotischen Zelllinien in Suspensionskultur
  • Herstellung von translationsaktiven Lysaten und deren Integrierung in zellfreie Systeme
  • Entwicklung eukaryotischer zellfreier Translationssysteme
  • Test neuer Zelllinien auf ihre In-vitro-Expressionsfähigkeit
  • Validierung von DNA und mRNA-Templaten
  • Integrierung von regulatorischen Sequenzen, Signalpeptiden, IRES-Sites, Aufreinigungs- und Fluoreszenz-Tags über die Generierung von linearen Templaten
  • Zellfreie Synthese von schwer zu exprimierenden Proteinen, wie zytotoxische Proteine und Membranproteine
  • Evaluierung der Proteinsynthese unter Verwendung verschiedener zellfreier Systeme (Lysate aus Insektenzellen, CHO-Zellen, kultivierte humane Zellen; E. coli und Weizenkeimlysate) im Batch und im Dialyse-Modus (CECF)
  • MS-Analysen von Peptiden, Proteinen (Identifizierung, Charakterisierung und Untersuchung von Modifikationen, wie Glykosylierung, Phosporylierung, Palmitylierung), Protein-Protein sowie Protein-Ligand Interaktionen
  • Bestimmung der Syntheseausbeute mittels (14C)-Protein-Labeling und TCA-Präzipitation
  • Charakterisierung der Proteinsynthese durch Gelelektrophorese, Autoradiographie und quantitatives Imaging im Phosphorimager Protein-Analyse mittels Fluoreszenz-Mikroskopie und Western Blotting

Fermentation von eukaryotischen Zelllinien

Die Basis für die zellfreie Proteinsynthese stellen eukaryotische Zelllysate dar. Um diese in translationsaktiver Form zu erhalten, werden definierte Zelllinien unter geeigneten Bedingungen kultiviert. Durch optimale Wachstumsbedingungen der Zelllinien als Suspensionskultur in chemisch definierten Medien in Fermentern und standardisierten Herstellungsprotokollen, wird eine gleichbleibende Qualität der Lysate für die zellfreie Synthese von Proteinen sichergestellt. Um die Vorteile der zellfreien Synthese von Proteinen auch für Synthesen der Ziel-Proteine in größeren Volumina zu ermöglichen, werden alle relevanten Prozesse gezielt in Liter-Volumina skaliert. Die kontinuierliche Reaktionsführung während der Fermentation, auch Perfusion genannt, wurde hierfür etabliert. Einhergehend mit einer anschließenden kontinuierlichen Aufarbeitung der Zellen, werden große Lysatchargen mit gleichbleibender Qualität erhalten.

Entwicklung neuer eukaryotischer zellfreier Expressionsysteme

Die stetige Weiterentwicklung der bestehenden Systeme, aber auch das Testen neuer Zelllinien auf deren generelle Expressionsfähigkeit, steht im Fokus dieses Projektes. Insbesondere die Etablierung von Lysaten basierend auf Säugerzelllinien ist von Bedeutung für industrielle Protein-Produktionsprozesse. Lysate aus fermentierten CHO-Zellen werden aktuell zur Marktreife gebracht.

Evaluierung von Proteinsynthesen in zellfreien Systemen

Jedes Protein besitzt unterschiedliche Ansprüche für eine optimale Synthese und Proteinfaltung. Diese hängen stark vom jeweiligen Proteintyp ab. Während für zytosolische Proteine die Systeme auf der Basis von E. coli oder Weizenkeimlysaten gut geeignet sind, ist die Synthese von z.B. Membranproteinen anspruchsvoller. Diese benötigen membranäre Strukturen mit einem aktiven Translokon für die gerichtete Integration in die biologische Membran. Die hierfür essentiellen Mikrosomen basierend auf Vesikeln des Endoplasmatischen Retikulums sind in den Lysaten basierend auf eukaryotische Zelllinien durch den schonenden Aufschluss der Zellen enthalten. Oft spielen aber auch Initiations- und Translationsfaktoren, Chaperone und tRNA-Limitationen für die korrekte Synthese und Faltung des Proteins eine wichtige Rolle.

Während einer Evaluierung von Proteinsynthesen in zellfreien Systemen, wird die generelle Expressionsfähigkeit des Templates untersucht. Hierfür kann ein vergleichendes Screening in verschiedenen Systemen (Lysate auf Basis von E. coli Zellen, kultivierten Insekten-, CHO- und humanen Zelllinien sowie Weizenkeimlysate) durchgeführt werden, um das optimale System für die Synthese des Zielproteins zu identifizieren. Als Template können neben Plasmiden auch lineare Konstrukte, wie PCR-Produkte, in denen die regulatorischen Elemente wie T7-Promoter, Ribosomenbindungstelle etc. enthalten sind, oder auch direkt mRNA verwendet werden. Um die maximale Proteinausbeute zu erzielen, kann eine Optimierung der Reaktionsbedingungen in einem definierten System durchgeführt werden.

Synthese von Toxinen

Die Synthese von Proteinen auf zellfreiem Wege bietet eine innovative Plattform, um z.B. proteinogene Toxine für analytische und pharmakologische Untersuchungen ohne großen Aufwand innerhalb kurzer Zeit herzustellen. Dies ist, wenn überhaupt, auf zellulärem Wege nur mit großem Aufwand möglich, da das synthetisierte Protein auf die Wirtszelle toxisch wirkt und diese abstirbt. Am Beispiel des thermostabilen Hemolysin (TDH), welches in Muscheln vorkommt und für eine Vielzahl von Unverträglichkeiten beim Menschen verantwortlich ist, konnte gezeigt werden, dass das auf zellfreiem Wege hergestellte TDH zytotoxische Aktivität aufweist. Das klonierungsfreie, auf PCR-Produkten basierende Produktionsverfahren ermöglicht eine extrem zeitsparende Toxinsynthese innerhalb weniger Stunden, ohne die Generierung genetisch modifizierter Organismen.

Zellkulturlabore der Sicherheitsklasse S1

  • 5 l Fermenter (Sartorius Biostat B DCU-II Advanced Additive Flow System; 2x 5 l Kessel, aufrüstbar mit bis zu 6 Gefäßen zwischen 1 und 10 l)
  • 30 l Fermenter (Sartorius Biostat D DCU)
  • konfokales Laserscanning-Mikroskop (Zeiss CLSM 510)
  • automatisierte Zellassay- und Screening-Einheit (PerkinElmer; CellLuxCellularFluorescence Workstation)

Isotopenlabor

  • Proteinmarkierung (Umgang mit 14C, 32P, 35S)
  • Absauganlage für die Abtrennung von 14C-markierten Proteinpräzipitaten (TCA-Präzipitation)
  • Szintillationszähler (Beckmann LS 6500 Multi Purpose Scintillation Counter)
  • Geltrocknungsanlage für Autoradiogramme (Unigeldryer 3545)
  • Typhoon Trio+ variable-mode-Imager (Radioaktivität, Fluoreszenz und Chemilumineszenz mit erweitertem 10 µm Pixel-Scan)

Labore der Sicherheitsklasse S1 für molekularbiologische Arbeiten

  • Multimode Reader Berthold LB 941 vi-S TriStar (Flash-, Glow- und Farb-Lumineszenz, Absorption, Fluoreszenz, FRET, BRET)
  • Sirius single tube Luminometer (Titertek Berthold)
  • Spektralphotometer für UV/Vis (Nanodrop ND-2000c)
  • Bioreaktoren für die zellfreie Proteinsynthese im Batchverfahren und im Dialysemaßstab

Massenspektrometrie in Laboren der Sicherheitsklasse S1

  • Massenspektrometer Q-TOF MaxIs Impact (Bruker Daltonics) mit austauschbaren Ionenquellen (offline nanoESI source, conventional ESI source, captive spray für die Nano-LC Kopplung)
  • Ultra-sensitive Ionenfalle AmaZon Speed ETD (Bruker Daltonics) mit austauschbaren Ionenquellen (conventional ESI source, captive spray für die Nano-LC Kopplung)
  • UHPLC Chromatographieanlagen, Ultimate 3000 nanoRSLC system (Dionex)

Analytik von Membranproteinen in Laboren der Sicherheitsklasse S1

  • Patch-Clamp System »Port-A-Patch« und Orbit 16 der Firma Nanion
  • Partikelanalyse mittels »Zetasizer Nano ZS« der Firma Malvern

  • Thoring L, Wüstenhagen DA, Borowiak M, Stech M, Sonnabend A, Kubick S. Cell-Free Systems Based on CHO Cell Lysates: Optimization Strategies, Synthesis of »Difficult-to-Express« Proteins and Future Perspectives. PLoS One. 2016 Sep 29;11(9):e0163670. DOI dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0163670 Artikel
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