Mikrosysteme für In-vitro-Zellmodelle

Die Arbeitsgruppe bietet anwendungsnahe und kundenspezifische Entwicklungen von Verfahren und Prototypen für die Kultivierung, Charakterisierung und Prozessierung anspruchsvoller Zellproben an. Die Grundlage innovativer Lösungskonzepte ist unsere Expertise bei Mikroreaktoren, Mikrofluidik, Sensorik und funktionalen Polymerbeschichtungen. Diese wird ergänzt durch fundiertes Know-how in den Bereichen Zellbiologie, Toxikologie und Bioanalytik. Die interdisziplinäre Ausrichtung der Arbeitsgruppe ermöglicht eine fundierte und zielorientierte Beratung sowie eine effiziente Bearbeitung Ihrer speziellen Aufgabenstellung. Die Schwerpunkte der Aktivitäten umfassen (i) die Entwicklung von In-vitro-Testverfahren für die Bewertung der Toxizität von Wirkstoffen und Chemikalien auf der Basis hochfunktionaler Mikrobioreaktoren und anspruchsvoller Zellmodelle, sowie (ii) die Etablierung intelligenter Polymerbeschichtungen, die es erlauben, das Verhalten adhärenter Zellen auf technischen Oberflächen zu steuern. Für all diese Entwicklungsaufgaben steht modernste Ausstattung zur Verfügung.

  • Design und Entwicklung von Mikrobioreaktoren für die Langzeitkultivierung anspruchsvoller Zellmodelle
  • Integration von Mikrosensoren in mikrofluidische Systeme zur Echtzeit-Erfassung von Kenngrößen von Zellmedien (z.B. Sauerstoff, pH, Glukose, Laktat)
  • Entwicklung von In-vitro-Testsystemen zur Bewertung der Toxizität von Chemikalien, pharmazeutischen Wirkstoffen und Bestandteilen von Kosmetika
  • Entwicklung und Herstellung funktionaler Beschichtungen für Anwendungen im Bereich Zellkultivierung und Tissue Engineering: Beschichtungen aus thermoresponsiven Polymeren zur Kontrolle der Zelladhäsion auf Zellkultursubstraten, Polyelektrolytschichten (Layer-by-Layer-(LbL)-Auftragung) als Reservoire für Biomoleküle zur Steuerung von adhärenten Zellen, Schichten (Self assembled monolayers (SAM)) aus Polymeren und Biomolekülen zur Verbesserung der Biokompatibilität synthetischer Oberflächen
  • Techniken zur Herstellung homogener und strukturierter Beschichtungen: Spin Coating, Dip Coating, Sprühen, Spotten, Drucken (µ-Contact Printing)
  • Umfangreiches Methodenspektrum zur nichtinvasiven Untersuchung und Charakterisierung von Oberflächen und Beschichtungen: Kontaktwinkel-Bestimmung, Ellipsometrie, Oberflächenplasmonen-Spektroskopie (SPR), fluoreszenzmikroskopische Techniken, Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP), Rasterkraftmikroskopie (AFM)
  • Zeitaufgelöste Untersuchung der Zelladhäsion auf funktionalisierten Oberflächen mittels Totalreflexionsmikroskopie (TIRFM)
  • Charakterisierung mechanischer Eigenschaften von Oberflächen und Beschichtungen mittels Mikroindentation
  • Einlagerung und Kultivierung von eukariotischen Zellen auf S1-Ebene (Säugertierzellen, Insektenzellen, Primärzellen, Zelllinien)

Mikrofluidischer Bioreaktor für Hepatozythen

Mikrobioreaktor für Leberzellen zur Bewertung der Toxizität von Chemikalien, wie z.B. Wirkstoffen
© Foto Fraunhofer IZI

Mikrobioreaktor für Leberzellen zur Bewertung der Toxizität von Chemikalien, wie z.B. Wirkstoffen. In dem Reaktor kann die metabolische Aktivität der Zellen über mehrere Wochen in Echtzeit vermessen werden. Dazu sind sauerstoffsensitive Mikropartikel (oben links) zusammen mit Leberzellen in kleinen Kavitäten (oben rechts) deponiert. Die Partikel können einfach optisch ausgelesen werden. Der Graph (links unten) zeigt deutlich zwei durch ihre Kinetik unterscheidbare Wirkmechanismen des Schmerzmittels Acetaminophen (Paracetamol).

Das Schema stellt die vollautomatisierte Probenentnahme aus einem Mikrobioreaktor (in rot) zur regelmäßigen Bestimmung der Glukose- und Laktatkonzentrationen dar
© Foto Fraunhofer IZI

Das Schema stellt die vollautomatisierte Probenentnahme aus einem Mikrobioreaktor (in rot) zur regelmäßigen Bestimmung der Glukose- und Laktatkonzentrationen dar. Mit diesen Informationen lässt sich die metabolische Aktivität von Leberzellen evaluieren. Dies legt eine wichtige Grundlage für die Entwicklung von In-vitro-Assays zur Evaluierung der Toxizität von Wirkstoffen.

Die Arbeitsgruppe entwickelt In-vitro-Testverfahren für die Beurteilung der Langzeit-Toxizität von Wirkstoffen, um mittelfristig Tierversuche zu ersetzen. Die Aufrechterhaltung der Vitalität von Zellkulturen über hinreichend lange Zeiten setzt dabei die kontinuierliche Überwachung der Kultivierungsbedingungen voraus. Die Konzentrationen von Glukose, Sauerstoff, sowie wie der pH-Wert des Zellkulturmediums im Bioreaktor sind hierbei die wichtigsten Parameter. Die kontinuierliche Messung dieser Größen erlaubt nicht nur eine rigorose Qualitätskontrolle, sondern liefert auch die Eingangssignale für einen automatisierten Betrieb des Mikroreaktors. Ein wesentlicher Teil der Aktivitäten der Arbeitsgruppe ist dabei der Entwicklung von Sensortechnologie und deren Integration in die Mikroreaktoren gewidmet. Die Herausforderungen ergeben sich dabei aus der Miniaturisierung und damit einhergehend aus den winzigen, zur Verfügung stehenden Probenvolumina sowie den Anforderungen an die Langzeitstabilität.

Thermoresponsive Polymerbeschichtungen zur Steuerung von Zelladhäsion

Kontrolle der Zelladhäsion auf thermoresponsiven Oberflächen
© Foto Fraunhofer IZI

Kontrolle der Zelladhäsion auf thermoresponsiven Oberflächen. Bei 37 °C sitzen die Zellen adhärent und ausgebreitet auf den Oberflächen. Bei Absenkung der Oberflächentemperatur auf 25 °C lösen sich die Zellen von ihrem Substrat und können durch einfaches Spülen entfernt werden.

Kontrolle der Zelladhäsion auf strukturierten thermoresponsiven Oberflächen
© Foto Fraunhofer IZI

Kontrolle der Zelladhäsion auf strukturierten thermoresponsiven Oberflächen. Thermoresonsive Mikrogele können auf vielen Oberflächen lokal aufgebracht werden (in diesem Fall in kreisrunden Inseln). Bei 37 °C bilden sich homogene Zellen aus (1). Mit Absenkung der Oberflächentemperatur auf 25 °C lösen sich die Zellen selektiv von ihrem Substrat (2 & 3). Wenn die Temperatur wieder erhöht wird, besiedeln die Zellen wieder die thermoresponsiven Bereiche (4).

Die Arbeitsgruppe entwickelt thermoresponsive Polymerbeschichtungen, auf denen Zellen bei typischen Kultivierungstemperaturen gut adhärieren. Wird die Temperatur um wenige Grad reduziert, lassen sich die Zellen durch einfaches Spülen von diesen Beschichtungen ablösen, ohne dass invasive Enzymcocktails notwendig wären. So ist sichergestellt, dass die Vitalität der Zellen bei diesem oftmals kritischen Prozessschritt nicht beeinträchtigt wird. Die Polymere können homogen oder in definierten Mustern mit einfachen Methoden, wie Spin-Coating, Spotting oder Drucken, auf fast allen gängigen Zellkultursubstraten kostengünstig aufgetragen werden. So lässt sich der Anwendungsbereich der thermoresponsiven Beschichtungen über die schonende Durchführung von Standardprotokollen hinaus beträchtlich ausweiten. So können Cokulturen mit definierten geometrischen Beziehungen mit diesem Ansatz einfach hergestellt werden. Tests zeigen, dass sich mit den Polymerbeschichtungen die Handhabung von Zellassays, z.B. für Wundheilung oder Zellmigration, beträchtlich verbessern lässt, wobei zusätzlich Zuverlässigkeit und Präzission zunehmen. Die Etablierung neuartiger Zellassay-Formate stellt einen weiteren Teil der Aktivitäten der Arbeitsgruppe dar.

Durch Erniedrigung der Kultivierungstemperatur von 37 °C auf 28 °C geht ein thermoresponsives Zellkultivierungssubstrat von einem zellattraktiven in einen zellabstoßenden Zustand über. Dies führt zu einer nichtinvasiven Ablösung der Zellen vom Substrat.

Abbildung der Kontaktfläche von Fibroblasten auf einem thermoresponsiven Zellkultivierungssubstrat während der Zellablösung.

  • Durchlicht- und Auflichtmikroskopie mit Hellfeld-, Phasenkontrast-, Fluoreszenz-, Polarisations- und Totalreflexionseinrichtung (TIRFM), höchstauflösende optische Mikroskopie (SIM), jeweils mit rechnergesteuerten und temperierbaren Objekttischen und Zellkulturkammern ausgerüstet
  • Konfokales Raster-Laser-Mikroskop mit 3D-Bildverarbeitung
  • Vollautomatisierte Fluoreszenzmikroskope für Aufnahmen lebender Zellen unter physiologischen Bedingungen (Time-Lapse-Mikroskopie) (Olympus CellR)
  • TIRF-Mikroskopie (Olympus)
  • Laser Tweezer / optische Pinzette mit Laser-Mikrodissektion (Palm / Zeiss)
  • Rasterkraftmikroskopie für biologische Anwendungen / Bio-AFM (JPK)
  • Variables Mikrofluidik-Setup
  • Labor für Oberflächenchemie und -biochemie
  • Multiskop für abbildende Ellipsometrie, Oberflächen-Plasmonenresonanz / SPR (Optrel)
  • Bedampfungsanlage zur Herstellung dünner metallischer Schichten (Edwards)
  • Microcontact Printer (GeSiM)
  • Kontaktwinkelmessgerät
  • 200 m² vollausgestatteter Zellzuchtbereich
  • Durchflusszytometer (Becton D.)
  • Hochdurchsatz-Platten-Reader (CellLux)
  • Mikromanipulation, Mikroinjektion, Mikrodissektion (Eppendorf)
  • Kryokonservierung von Zellen
  • Zellcharakterisierung: Zellfärbetechniken (z.B. Immunfluoreszenz), Transfektion mit fluoreszierenden Fusionsproteinen, Lebenfärbung, Proliferationstests

  • GeSiM mbH, Großerkmannsdorf
  • Mikrofluidik ChipShop, Jena
  • BST Bio Sensor Technology GmbH
  • University of Jerusalem, Israel
  • Ecole Polytechnique Federal Suisse, Lausanne, Schweiz
  • Centre Suisse dElectronique et Microtechnique Neuchâtel, Schweiz
  • Universität Bielefeld
  • Nottingham Trent University

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Patente

  • Jaeger M, Prill S, Nahmias Y, Bavli D. Method and system for continous monitoring of toxicity. EP15160661.3 / US 2015/0268224 A1
  • Duschl C, Lankenau A, Lutz J-F, Laschewsky A, Wischerhoff E, Fuhr GR, Bier F. Substrat, Kultivierungseinrichtung und Kultivierungsverfahren für biologische Zellen. DE 10 2010 012 254 A1. 22. Sept. 2011.
  • Duschl C, Hellweg T, Lankenau A, Laschewsky A, Lutz J-F, Schmidt S, Wischerhoff E. Thermoresponsives Substrat mit Mikrogelen, Verfahren zu dessen Herstellung und Kultivierungsverfahren für biologische Zellen. DE 10 2010 012 252 A1. 22. Sept. 2011.