Mikrofluidische Zellprozessierung und Zellanalytik

Die Arbeitsgruppe bietet anwendungsnahe und kundenspezifische Entwicklungen von Verfahren und Prototypen für die Prozessierung und Manipulation anspruchsvoller biologischer Proben an. Ein Schwerpunkt ist die Manipulation einzelner Objekte, z.B. die schonende und vielseitige Handhabung einzelner Zellen und besonders kleiner Zellproben in mikrofluidischen Chips. Dazu werden meist elektrische Felder im Radiofrequenzbereich genutzt. Für komplexere Aufgaben werden diese mit komplementären Manipulationsverfahren, wie z.B. optischen Pinzetten oder mikrofluidischen Verfahren kombiniert.

Daneben widmet sich die Arbeitsgruppe der Integration von Sensortechnologie in mikrofluidische Bauteile zur Erfassung wichtiger Kenngrößen von Zellen und anderen komplexen, biologischen Proben. Für diese Entwicklungsaufgaben steht modernste Ausstattung zur Verfügung.

  • Funktionale Zell-Assays und Zell-Analytik (z.B. Chemotaxis, Neuritenwachstum, Stammzelldifferenzierung, Calcium signaling, Cytotoxizität, etc.)
  • Entwurf und Aufbau chip-basierter Mikrosysteme für die zellverträgliche Injektion physiologischer Suspensionen in Mikrofluidiken, berührungsloses Handhaben einzelner oder weniger biologischer Objekte (Zellen, Bakterien, Viren) und gezielte Ablage zuvor charakterisierter Teilchen zur weiteren Kultivierung
  • Design und Entwicklung mikrofluidischer Systeme (chips, Peripherie, Detektion) in der Biotechnologie und Zellbiologie
  • Mikrosysteme für die kontrollierte Translation und Rotation suspendierter Mikropartikel
  • Manuelles, halbautomatisches und automatisches Sortieren von Mikroobjekten (z.B. lebender Zellen) in kontinuierlichen Durchflußsystemen
  • Zentrifugationsfreies Waschen und Beladen lebender Zellen mit z.B. pharmazeutischen Agenzien in mikrofluidischen Durchflußsystemen
  • Dielektrische Charakterisierung komplexer Teilchen auf Einzelzellebene
  • Chipbasierte Elektromanipulation (z.B. Fusion) seltener Zellen (z.B. Stammzellen)
  • Kombination dielektrischer Feldfallen und optischer Pinzetten zur simultanen Manipulation mehrerer Objekte und zur Charakterisierung von Wechselwirkungen (Bindungskräften) zwischen Teilchen
  • Optische Mikroskopie auf High End-Niveau, z.B. hoch lichtempfindliche Fluoreszenzmessungen
  • Numerische Kalkulation und Modellierung mit Hilfe der Finite-Elemente-Methode
  • Einfluss elektrischer Wechselfelder (10 kHz bis 250 MHz) auf biologische Objekte
  • Mikromanipulation einzelner Objekte mittels Kapillaraspiration
  • Mikroprozessierung mittels UV-Laserablation
  • Kultivierung tierischer und Hefekulturen auf S1-Ebene vor und nach ihrer Manipulation in mikrofluidischen chips
  • Kinetische Bindungsstudien zur Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung in Mikrokanälen
  • Zeitaufgelöste Fluoreszenzmikroskopie lebender Zellsysteme
  • Immunoassays zur Detektion von Blut- und Plasmaproteinen
  • Blutarbeitsplatz für Hämokompatibilitätstests
  • Photolithographische Prozessstrecke
  • Mikrostrukturierung metallisierter Oberflächen mittels Photolithographie
  • Herstellung von Mikrokontaktstempeln und Etablierung des Stempelprozesses

Einzelzell-Handhabung

Gezielte Kontaktierung einer einzelnen T-Zelle mit einem funktionalisierten Mikropartikel in einem Mikrokanal.
© Foto Fraunhofer IZI

Gezielte Kontaktierung einer einzelnen T-Zelle mit einem funktionalisierten Mikropartikel in einem Mikrokanal. Der durch die Bindung der Zelle an die Partikeloberfläche ausgelöste Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration wurde mit einem Calcium-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff gemessen.

Die Arbeitsgruppe verfügt über jahrelange Erfahrung auf dem Gebiet der Handhabung wertvoller Zell-Proben auf Ebene der einzelnen Zelle. Mit Hilfe frei konfigurierbarer Mikroelektroden, die in Mikrofluidiken integriert werden, können einzelne Zellen gezielt aus einer Suspension selektiert werden. Die selektierten Zellen können sortiert, zentrifugationsfrei in andere Medien überführt sowie zum Zwecke der Fusion oder eines Signaltransfers kontrolliert miteinander in Kontakt gebracht werden. Dies ist etwa bei der immunologischen Zellaktivierung oder bei der Initiation der Stammzelldifferenzierung von Interesse. Auch die Quantifizierung von Bindungskräften zwischen zwei Zellen oder mikroskaligen Objekten ist mit unserer Technologie möglich.

Einzelzellfusion einer P3X-Myeloma-Zelle mit einer B-Zelle in einem dielektrischen Feldkäfig

Individuell ausgewählte Zellen werden zunächst über dielektrophoretische Kräfte gefangen bzw. gepaart, wodurch ihre Zellmembranen in engen Kontakt gebracht werden. Die Fusion der Zellen wird dann durch die Applikation eines kurzen Spannungspuls (im Video durch ein Blitzlicht dargestellt) initiiert. Etwa zwei Minuten nach Applikation des Pulses beginnt das Abbild der Zellmembranen an der Kontaktstelle zu verschwimmen. Etwa drei Minuten nach Pulsapplikation sind die trennenden Membranabschnitte gänzlich verschwunden und ein einzelnes Heterokaryon ist entstanden.

Berührungslose Handhabung einzelner Zellen in einem Dielektrophorese-basierten mikrofluidischen System

Durch nacheinander angeordnete Deflektorelemente und dielektrophoretische Weichen (im Video schwarz; aktive Elemente sind durch eine weiße Linie markiert) werden individuell ausgewählte Zellen (Pfeile) von ihren ursprünglichen Trajektorien abgelenkt und quer zu den Strömungslinien im Kanal in ein zickzackförmiges Halteelement überführt. Dort werden sie gegen die Flüssigkeitsströmung im Kanal gehalten, wodurch eine Überspülung mit aktiven Substanzen bzw. Farb- und Waschlösungen möglich wird.

Berührungslose Rotation einer Säugetierzelle in einem dielektrischen Feldkäfig

Zunächst wird die Zelle mittels dielektrophoretischer Kräfte in einem dielektrischen Feldkäfig gefangen, welcher aus acht Mikroelektroden (im Bild schwarz) besteht: Vier am Boden und vier an der Decke des Mikrokanals. Durch das Anlegen von um 90° phasenverschobenen Radiofrequenzfeldern an diese acht Elektroden kann die Zelle um jede beliebige Raumachse rotiert werden. Maßbalken: 10 µm.

Kontaktierung einer einzelnen T-Zelle mit einem bioaktiv beschichteten Mikropartikel in einem Dielektrophorese-basierten mikrofluidischen System

Einzeln ausgewählte Zellen bzw. Partikel werden dielektrophoretisch in ein zickzackförmiges Halteelement überführt, wo sie gegen die Flüssigkeitsströmung im Kanal berührungslos gehalten werden. Durch Überführung von Zelle und Partikel in die gleiche Halteposition werden die Objekte miteinander kontaktiert und die T-Zelle somit stimuliert.

Mikrofluidische Teststände für Hämokompatibilitätstests

Mikrofluidisches System zur exakten Kontrolle der zellulären Mikroumgebung
© Foto Fraunhofer IZI

Mikrofluidisches System zur exakten Kontrolle der zellulären Mikroumgebung. Das System kann über HPLC-Schläuche mit Präzisionsspritzenpumpen verbunden werden und ist für die hochauflösende Mikroskopie zugänglich.

Im Zuge der Entwicklung bioverträglicher Implantatoberflächen sind zellkulturbasierte Testsysteme ein wichtiges diagnostisches Werkzeug, um die Interaktion der neuen Materialien mit lebendem Gewebe mit geringem Aufwand beurteilen zu können. Im Falle von kardiovaskulären Implantaten stellen strömungsabhängige Reaktionen z.B. des Gerinnungssystems besondere Herausforderungen an die Testumgebung, da hier Parameter wie Probengeometrie, Flussraten und Strömungsverhältnisse berücksichtigt werden müssen.

Ziel des laufenden Projekts ist die Entwicklung von mikrofluidischen Testständen, mit denen die Hämokompatibilität von Beschichtungen kardiovaskulärer Implantate sowie die Hämokompatibilität ganzer Implantatbausteine effizient und parallelisiert, unter kontrollierten Versuchsbedingungen (z.B. Strömung, Medienzusammensetzung, etc.) sowie mit geringerem Materialaufwand als bisher, in vitro evaluiert werden kann.

Mikropartikel als Sensoren für die Bioanalytik

Anhäufung von Mikropartikeln in einem Mikrokanal mittels Dielektrophorese.
© Foto Fraunhofer IZI

Anhäufung von Mikropartikeln in einem Mikrokanal mittels Dielektrophorese. Die Partikel werden gegen den Flüssigkeitsstrom (rote Pfeile) berührungslos zurückgehalten, und können auf Knopfdruck wieder entlassen werden.

Die meisten bioanalytischen Verfahren erfordern immer noch zu aufwendige und zu kostspielige Komponenten und Gerätschaften. In diesem Projekt werden dielektrische Mikropartikel als Sensoren für Biomoleküle auf der Basis von sogenannten »Whispering Gallery Modes« (WGM) für den Einsatz in mikrofluidischen Bauteilen entwickelt. Dabei kommen die Vorteile der Partikel optimal zur Geltung: Sie sind sehr flexibel einsetzbar, da sie frei im Analyten diffundieren können, sie benötigen nur kleinste Probenvolumina und zudem können sie mit einfachsten Methoden ausgelesen werden.

Mikrosysteme zur Kontrolle neuronalen Zellwachstums

Neuronales Netzwerk auf einem Zellkultursubstrat, welches mikrostrukturiert mit thermoresponsiven Polymeren beschichtet ist.
© Foto Fraunhofer IZI

Neuronales Netzwerk auf einem Zellkultursubstrat, welches mikrostrukturiert mit thermoresponsiven Polymeren beschichtet ist. Die Position der Zellkörper wird durch die geometrische Struktur der Oberflächenbeschichtung vorgegeben. Deutlich erkennbar sind die Neurite, über welche die einzelnen Zellgruppen miteinander verbunden sind.

Die Analyse künstlicher neuronaler Netzwerke ist ein vielversprechender Ansatz zur Adressierung zahlreicher neurobiologischer Fragestellungen. Trotz intensiver Bemühungen weltweit ist es jedoch noch nicht in zufriedenstellender Weise gelöst, die synaptische Übertragungsrichtung zwischen den einzelnen Zellen eines solchen Netzwerks in vitro zu kontrollieren, was z.B. die Aufklärung der Form-Funktion-Beziehung in neuronalem Gewebe erschwert.

Mittels Mikrofertigungstechniken und in enger Kooperation mit der benachbarten Arbeitsgruppe Mikrosysteme für In-vitro-Zellmodelle werden in diesem Projekt Zellkultursubstrate mit Oberflächenbeschichtungen aus thermoresponsiven Polymeren (TRP) entwickelt, mit denen neuronale Netzwerke mit definiertem Verbindungsmuster erzeugt werden können. Die hierfür eingesetzten TRP können temperaturabhängig von einem zellabweisenden in einen zelladhäsiven Zustand überführt werden, wodurch die Zugänglichkeit einer TRP-beschichteten Substratoberfläche für Zellen und auswachsende Neurite dynamisch und µm-genau kontrolliert werden kann. Ziel ist es, neue methodische Zugänge zu wichtigen neurowissenschaftlichen Fragestellungen in der Grundlagenforschung oder im Rahmen der pharmazeutischen Wirkstoffentwicklung zu schaffen.

Ein photonisch-mikrofluidisches Produktionsverfahren zur ultraschnellen Herstellung maßgeschneiderter monoklonaler Antikörper

Zellpärchen im mikrofluidischen System. Die Zeitrafferaufnahme zeigt den hochkontrollierten Fusionsprozess der Zellen. Ausgelöst wird die Fusion durch einen elektrischen Impuls an den das Zellpärchen umgebenden Mikroelektroden (im Bild schwarz). Maßbalken: 10 µm. Zeit zwischen den Bildern: 1 min.
© Foto Fraunhofer IZI

Zellpärchen im mikrofluidischen System. Die Zeitrafferaufnahme zeigt den hochkontrollierten Fusionsprozess der Zellen. Ausgelöst wird die Fusion durch einen elektrischen Impuls an den das Zellpärchen umgebenden Mikroelektroden (im Bild schwarz). Maßbalken: 10 µm. Zeit zwischen den Bildern: 1 min.

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Monoklonale Antikörper gehören zu den weltweit am häufigsten eingesetzten Bindemolekülen. Zentraler Bestandteil des herkömmlichen Produktionsverfahrens ist die (unkontrollierte) Zellfusion von Myeloma- und B-Zellen. Über aufwändige Selektionsschritte müssen hierbei aus Millionen unerwünschter Nebenprodukte einzelne, antikörperproduzierende Zellen mit den gewünschten Bindungseigenschaften identifiziert werden. Dies treibt Aufwand und Kosten der Antikörperentwicklung in enorme Höhen.

Ziel des Vorhabens ist die Etablierung eines Verfahrens, mit dem geeignete B-Zellen bereits im Vorfeld der Fusion fluoreszenzoptisch identifiziert und mittels eines mikrofluidischen Protokolls einer kontrollierten Fusion mit Myeloma-Zellen auf Einzelzell-Ebene zugeführt werden können. Dadurch entfallen die aufwändigen Selektionsschritte nach der Fusion, was Aufwand und Kosten auf ein Minimum reduziert und die Herstellung maßgeschneiderter Antikörper so in weniger als drei Wochen ermöglichen soll.

Das Vorhaben wird in enger Kooperation mit dem Lehrstuhl »Physikalische Chemie« sowie der Arbeitsgruppe »Immuntechnologien« der Universität Potsdam durchgeführt und wird finanziell unterstützt durch die Europäische Union.

  • Mikrofluidik mit rechnergesteuerten Pumpensystemen
  • Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop (Zeiss LSM510)
  • Vollautomatisierte Fluoreszenzmikroskope für Zeitrafferaufnahmen lebender Zellen (Olympus Cell^R)
  • Laser Tweezer / optische Pinzette mit Laser-Mikrodissektion (Palm/Zeiss)
  • Microcontact Printer (GeSiM)
  • Dielektrophorese mit rechnergesteuerten 32-Kanal-Generatoren für die Einzelzellmanipulation und Handhabung geringer Partikelzahlen in mikrofluidischen Chips
  • Excimer-Laser-Ablationsanlage (Wellenlänge: 248 nm)
  • Durchlicht- und Auflichtmikroskopie mit Hellfeld-, Phasenkontrast-, Fluoreszenz-, Polarisations- und Totalreflexionseinrichtung (TIRFM) sowie rechnergesteuerten und temperierten Objekttischen und Zeitraffermöglichkeit
  • Abbildende Infrarotthermometrie
  • CAD-Entwurfseinrichtung
  • Konfokales Rasterlasermikroskop mit 3D-Bildverarbeitung
  • Numerische Kalkulationen mittels Finite-Elemente-Methode
  • Optische Pinzette (Laser Tweezers) mit kombiniertem UV-Laser zum Laser-Schneiden
  • Gefrierpunktosmometrie
  • Photolithographische Prozessstrecke
  • Mikromechanische Werkstatt
  • Blutarbeitsplatz

  • Fraunhofer-Institut für Angewandte Polymerforschung, Forschungsbereich Life Science und Bioprozesse
  • GeSiM Gesellschaft fuer Silizium-Mikrosysteme mbH
  • Surflay Nanotec GmbH
  • NanoBioAnalytics
  • Universität Rostock, Lehrstuhl für Biophysik
  • Tel Aviv University, OMNI Group
  • microfluidic ChipShop GmbH

Publikationen

  • Habaza M, Kirschbaum M, Guernth-Marschner C, Dardikman G, Barnea I, Korenstein R, Duschl C, Shaked NT. Rapid 3D Refractive-Index Imaging of Live Cells in Suspension without Labeling Using Dielectrophoretic Cell Rotation. Advanced Science (2016), in press
  • Kirschbaum M, Jaeger MS, Duschl C. Measurement of surface-mediated Ca2+ transients on the single-cell level in a microfluidic Lab-on-a-Chip environment. Methods Mol Biol. (2015);1272:247-56
  • Schreml S, Meier RJ, Kirschbaum M et al. Luminescent Dual Sensors Reveal Extracellular pH-Gradients and Hypoxia on Chronic Wounds That Disrupt Epidermal Repair. Theranostics. (2014), 4, S. 721-735.
  • Guernth-Marschner C, Kirschbaum M, Jaeger MS, Duschl C. Electrofusion of cells in microdevices. Cell News. (2013), 39(3), 14-18.
  • Kirschbaum M, Gürnth-Marschner CR, Cherré S, de Pablo Peña A, Jäger MS, Kroczek RA, Schnelle T, Müller T, Duschl C. Highly controlled single-cell electrofusion in dielectrophoretic field cages. Lab on a Chip. (2012), 12, S. 443-450.
  • Guido I, Xiong C, Jaeger MS, Duschl C. Microfluidic system for cell mechanics analysis through dielectrophoresis. Microelectron Eng. (2012), 97:379-382
  • Boettcher M, Schmidt S, Latz A, Jaeger MS, Stuke M, Duschl C. Filtration at the microfluidic level: enrichment of nanoparticles by tunable filters. J Phys Condens Mat. (2011), 23, 324101
  • Guido I, Jaeger MS, Duschl C. Dielectrophoretic stretching of cells allows for characterization of their mechanical properties. Eur Biophys J. (2011), 40:281-288.
  • Guido I, Jaeger MS, Duschl C. Influence of medium consumption on cell elasticity. Cytotechnology. (2010), 62, 257-263.
  • Kirschbaum M, Jaeger MS, Duschl C. Correlating short-term Ca2+ responses with long-term protein expression after activation of single T cells. Lab Chip. (2009), 9, 3517-3525.
  • Kirschbaum M, Jaeger MS, Schenkel T, Breinig T, Meyerhans A, Duschl C. T cell activation on a single-cell level in dielectrophoresis-based microfluidic devices. J Chromatogr A. (2008), 1202, 83–89.
  • Böttcher M, Jäger MS, Kirschbaum M, Müller T, Schnelle T, Duschl C. Gravitation-driven stress-reduced cell handling. Anal Bioanal Chem. (2008), 390, 857-863.
  • Storn V, Kirschbaum M, Schlosshauer B, Mack AF, Fricke C. Electrical stimulation-induced release of beta-endorphin from genetically modified neuro-2a cells. Cell Transplant. (2008), 17(5):543-8
  • Fiedler S, Müller T, Zwanzig M, Jäger MS, Böttcher M, Csáki A, Fritzsche W, Howitz S, Schmitt D, Hampp N, Scheel W, Fuhr GR, Reichl H. Touchless Component Handling Towards Converging Assembly Strategies. mst news. (2008), 3, 25-28.
  • Jaeger MS, Uhlig K, Schnelle T, Mueller T. Contact-free single-cell cultivation by negative dielectrophoresis. J Phys D Appl Phys. (2008), 41:175502.
  • Jaeger MS, Mueller T, Schnelle T. Thermometry in dielectrophoresis chips for contact-free cell handling. J Phys D Appl Phys. (2007), 40:95–105
  • Böttcher M, Jäger MS, Riegger L, Ducrée J, Zengerle R, Duschl C. Lab-on-chip-based cell separation by combining dielectrophoresis and centrifugation. BRL. (2006), 1(4):443-451.
  • Wiklund M, Guenther C, Lemor R, Jaeger M, Fuhr G, Hertz HM. Ultrasonic standing wave manipulation technology integrated into a dielectrophoretic chip. Lab Chip. (2006), 6:1537–1544.
  • Stuke M, Mueller K, Mueller T, Hagedorn R, Jaeger MS, Fuhr GR. Laser-direct-write creation of three-dimensional OREST microcages for contact-free trapping, handling and transfer of small polarizable neutral objects in solution. Appl Phys A. (2005), 81:915-22.