Biomarkervalidierung und Assayentwicklung

Das Aufgabengebiet der Arbeitsgruppe umfasst u.a. die Entwicklung spezifischer Assays zur Validierung von Biomarkern sowie die Entwicklung und Adaption von Assays. Um Biomoleküle auf unterschiedlichsten Oberflächen z.B. Mikrotiterplatten, Objektträgern oder Membranen gezielt zu immobilisieren, kann auf eine Vielzahl unterschiedlicher Spotting- und Dispensiertechniken zurückgegriffen werden. Das Aufbringen der Proben kann mit Techniken, wie Kontaktwinkelmessungen und Elipsometrie, bestimmt und optimiert werden. Für Interaktionen aller Art können eine kinetische Analyse oder thermodynamische Messungen durchgeführt werden. Sämtliche Techniken werden kontinuierlich für (kunden)spezifische Anwendungen weiterentwickelt. Anwendungen sind u.a. systembiologische Projekte, die kinetische Analyse von Antikörpern sowie die Entwicklung von point-of-care Anwendungen z.B. für Drogen und Serumscreenings.

Veröffentlichungen der Abteilung Zellfreie Bioproduktion

  • Herstellung (Spotten) kundenspezifischer DNA-, Peptid- und Protein-Microarrays
  • Spotten auf unterschiedlichen Materialien, z. B. Glas, Plastik, Membranen, Mikrotiterplatten, Leiterbahnen etc.
  • Benchmarking diverser Contact- und Non-Contact-Spotter zur Auswahl des optimalen Systems (Referenzlabor für Liquiddispensiersystemen)
  • Durchführung von kundenspezifischen Microarray-Experimenten, Auswertung und Dokumentation
  • Optimierung der Experimente durch thermodynamische und kinetische Messungen
  • Übertragung anderer Assayformate auf Microarrays
  • Entwicklung und Etablierung von Assays für ELISA und Microarrays
  • Kolorimetrische, Fluoreszenz und elektrochemische Nachweissysteme
  • Serumscreening zur Identifizierung von krankheitsassoziierten Antikörperprofilen
  • Nachweis und Validierung von (potentiellen) Biomarkern in Körperflüssigkeiten
  • Epitopmapping von Antikörpern
  • Bead basierte Assays (Luminex Plattform)

Kontaktfreies Dispensieren von Flüssigkeiten im Picoliterbereich

Das Aufbringen von Lösungen und Flüssigkeiten sowohl im Kontakt- als auch im Nicht-Kontaktverfahren bietet viele Vorteile gegenüber dem manuellen Dispensieren. Ein automatisiertes Handling ist reproduzierbarer, kostenschonend und erlaubt eine Multiparameteranalyse auf kompakter Fläche. Die Geometrie, Beschaffenheit und Physik hinter der Dispensier- und Oberflächentechnik spielt eine entscheidende Rolle, wenn es um die Abgabe von Kleinstvolumina im unteren Picoliterbereich geht. Die Experten am Fraunhofer IZI-BB bieten daher das komplette Know-How von der Modifikation von Oberflächen über das Aufbringen der individuellen Probe bis hin zur Assayentwicklung an.

Durch die Verwendung spezieller Düsen / Pins kann, in einem Volumenbereich von 30pL–90nL, jede individuelle Anwendung optimal eingebunden werden. Somit können auch kleinste Probenmengen effektiv genutzt werden. Je nach Bedarf können somit DNA, RNA, Proteine, Peptide, Kleinstmoleküle oder aber auch ganze Zellen gespottet werden.

Durch die Verwendung dieser Technologien ist es am Fraunhofer IZI-BB möglich, u. a. humane Zellen mit einer Vitalitätsrate <95% zu spotten. Miniaturisierte Zellarrays verschiedenster Linien können somit zur Small-Compound-Analytik und Drug / Inhibitor Screening verwendet werden. Weitere Möglichkeiten umfassen: Protein-/Peptid-/DNA-/RNA Microarrays, Multiplexarrays im 96Well Maßstab, ivD und Point-of-Care-Anwendungen.

Durch die Vielfalt an Dispensiertechnologien und der großen Expertise der Arbeitsgruppe ist das kontaktlose Aufbringen nahezu jeder Flüssigkeit und / oder Lösung auf unterschiedlichste Oberflächen möglich.

Nachweis illegaler Drogen im Multiplexverfahren

Der zunehmende Konsum illegaler Drogen begründet den Bedarf an zuverlässigen und sensitiven Drogennachweissystemen, z. B. für Polizei und in der Notfallmedizin. Aktuell herrscht ein Mangel an einfachen und zuverlässigen Tests, die parallel verschiedene Drogen spezifisch nachweisen können (= Multiplexing). Bestehende Systeme sind meist nur in der Lage, Substanzklassen parallel nachzuweisen.

Das Projekt hat das Ziel, einen immunologischen Nachweis zu entwickeln, der in der Lage ist, mehrere Verbindungen innerhalb der geforderten Grenzen spezifisch nachzuweisen. Dieser soll in Zusammenarbeit mit dem LKA in Berlin getestet und validiert werden. Dafür wurden 9 der häufigsten konsumierten Drogen ausgewählt und Antikörper validiert. Es wurden sowohl kolorimetrische, als auch fluoreszenzbasierte Nachweissysteme auf verschiedenen Plattformen etabliert. Möglich sind qualitative und quantitative Nachweise in Serum mittels Blotverfahren, in Microtiterplatten oder auf Microarrays. Durch Microdispensiertechniken ist es gelungen, den Verbrauch an Probenmaterial und Reagenzien zu reduzieren.

Das angestrebte Ziel ist es eine Plattform zu entwickeln, die anwenderfreundlich und sensitiv ist und sich als zuverlässige Nachweismethode für Drogenmissbrauch etablieren kann.

NoPain

Die Deutsche Schmerzgesellschaft schätzt, dass etwa 13 Millionen Menschen in Deutschland unter chronischen Schmerzen leiden (Stand August 2013). Auf molekularer Ebene ist das Entstehen der Schmerzen bisher wenig charakterisiert. Die Entstehung von Schmerz beruht auf der Detektion und Verarbeitung von unterschiedlichen Signalen in nozizeptiven Neuronen, wobei eine Interaktion von verschiedenen Signalwegen erfolgt. Die Schmerzweiterleitung unterliegt einer komplexen Dynamik im Signalosom dieser Neurone. Einige relevante Pathways sind schon beschrieben worden, wobei unklar ist, wie ein Crosstalk zwischen diesen stattfindet. In Hinblick auf einen möglichen medizinisch therapeutischen Ansatz ist es von großer Bedeutung, den Crosstalk zwischen den Pathways zu verstehen und zu analysieren.

Ein entscheidender Faktor bei der Dynamik der Pathways und deren Crosstalk sind post-translationale Modifikationen, wie die Phosphorylierung. Phosphorylierungen werden eine große Bedeutung zugemessen, da sie oft für eine veränderte enzymatische Aktivität oder für eine veränderte Substratspezifität sorgen und so zu einer hohen Dynamik innerhalb und zwischen den Signalkaskaden führt. Ziel dieses Projektes ist es mittels Hochdurchsatzplatformen (Microarrays und Lumiex Plattform) eine nicht radioaktive Detektion von potentiellen Phosphorylierungsstellen an Proteinen bzw. Peptiden durchführen zu können.

Charakterisierung von HLA-Antigen-Antikörper Interaktionen

Akute Transplantationsabstoßungen und Transplantatüberlebensraten konnten in den letzten Jahrzehnten durch die Einführung neuer Immunsuppressiva deutlich verbessert werden. Immunsuppressiva unterdrücken die Abstoßung durch das zelluläre und humorale Immunsystem. Besonders das humane Leukozyten Antigen-System (HLA) spielt eine entscheidende Rolle bei der humoralen Immunantwort. Durch die genaue Charakterisierung der Anti-HLA-Antikörper können Informationen über das individuelle Risiko einer Anti-HLA-Antikörper-vermittelten Abstoßung gewonnen und die immunsuppressive Therapie optimiert werden.

Ziel ist die Anwendung der gesammelten Daten auf einen Systemmedizin basierten diagnostischen Test, der individuelle immunologische Risiken von Nierentransplantat-Patienten erkennt und personalisierte Therapien erlaubt. Dazu sollen Serumproben von Nierentransplantat-Patienten vor und nach der Transplantation zunächst auf das Vorhandensein von Anti-HLA-Antikörper untersucht und anschließend HLA-Epitop-/Bindespezifitäten bestimmt und kinetisch charakterisiert werden. Das Screening der Patientenproben auf Anti-HLA-Antikörper und die Differenzierung der HLA-Antikörperspezifitäten wird mit Bead-basierten Assays (Luminex FlexMap 3D) durchgeführt. Die Identifizierung der HLA-Epitop-/Antigen-Bindespezifitäten soll mittels Single Antigen Beads erfolgen. Bei Anti-HLA-Antikörper mit gleichen Antigen-Bindespezifitäten sollen zusätzlich kinetisch analysiert werden. Die Analyse erfolgt entweder über die Messung der Oberflächenplasmonresonanz (Flexchip) oder Protein-Microarrays.

Bio-Plex® 3D Suspension Array System

Auch besser bekannt unter dem Namen Luminex-Platform. Die Luminex Platform ist ein sogenanntes multiplex Bead-basiertes System zur gleichzeitigen Analyse von bis zu 500 Parametern. Dabei werden mit dieser Plattform bis zu 500 farblich kodierte Beads (magnetisch oder auch nicht magnetisch) verwendet. Jedes beliebige Molekül (z. B. DNA, RNA, Peptide, Proteine etc.) kann an die Beads gekoppelt und anschließend in einem ELISA-ähnlichen Format ausgelesen werden.

Biacore Flexchip

Mit dem Biacore Flexchip System können bis zu 400 Antikörper-Antigen-Interaktionen parallel gemessen und hinsichtlich ihrer kinetischen Parameter klassifiziert werden. Die Assoziationsrate gibt Aufschluss über die Länge der Inkubationszeit des Assays, während die Dissoziationsrate und die Gleichgewichtskonstante die Stabilität des Komplexes charakterisieren. Beides sind Kriterien, die für die Entwicklung eines diagnostischen Tests essentiell sind. Ein kinetisches Ranking erlaubt die Identifizierung eines Antikörper-Markers, der eine hohe Stabilität zu seinem Antigen aufweist und gleichzeitig eine kurze Inkubationszeit für die Bindung benötigt.

Non-contact liquid handling

Unter die kontaktfreie Handhabung von Flüssigkeiten fallen unter anderem das Aufbringen von Lösungen und Flüssigkeiten auf verschiedenste Oberflächen. Es kann sich dabei sowohl um schwierige Lösungen wie Serum oder Lysat handeln, aber auch um Standardanalyten wie DNA, RNA, Peptide und/oder Proteine. Hierzu stehen zwei verschiedene Geräte zur Verfügung, der sciFLEXARRAYER S5 und das instrumentTWO 400. Anwendungsbereiche findet diese Technologie in der Point-of-Care-Diagnostik, In-vitro-Diagnostik, in der Microarray Herstellung, der Peptidsynthese und vielen weiteren Anwendungen, die von einem automatischen Flüssigkeitshandling profitieren.

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