Kliniknahe Therapiestudien

© Foto Klinik und Poliklinik für Nuklearmedizin & Abteilung für Neuroradiologie, Universität Leipzig

Die Arbeitsgruppe Kliniknahe Therapiestudien prüft und entwickelt innovative Diagnose- und Therapieverfahren für den ischämischen Schlaganfall. Da die Übertragbarkeit von Befunden aus gängigen Labornagermodellen auf den menschlichen Patienten in manchen Fällen nur eingeschränkt möglich ist, wurde für den translationalen Ansatz ein weltweit einzigartiges Großtiermodell etabliert. Mit der Nutzung dieses Modells wird erreicht, dass ein therapeutisches oder diagnostisches Prinzip unter klinik- und patientennahen Bedingungen getestet werden kann. Im Schafmodell sind dabei sowohl die gyrenzephale Gehirnstruktur als auch die Gehirngröße der humanen Situation wesentlich näher als im Kleintier.

Auf Basis des Modells können sowohl Wirkstoffe als auch zelltherapeutische Ansätze entwickelt und evaluiert werden. Die funktionelle Charakterisierung erfolgt durch einen eigens dafür entwickelten sensomotorischen Verhaltenstest. Eine kliniknahe Bildgebung (CT, MRT, PET in Kooperation mit der Universität Leipzig) erlaubt strukturelle und morphologische Analysen, die durch umfangreiche histologische Untersuchungen ergänzt werden können.

Zusätzlich steht ein MRT-basiertes Stereotaxie-System für intrakranielle Applikationen zur Verfügung, das für therapeutische Zwecke (z.B. intrakranielle Stammzellgabe) oder zur Induktion von pathologischen Zuständen (z.B. Hirnblutungsmodell) eingesetzt wird.

Anästhesie

Grundlage für anspruchsvolle Untersuchungen stellt eine angepasste und sensitive Narkoseführung dar. In unserer Arbeitsgruppe sind verschiedenste Techniken zur Lokal- und Allgemeinanästhesie für Kurz- und Langzeitnarkosen etabliert. Neben Inhalationsnarkosen werden auch Perfusionsanästhesien (im MRT) eingesetzt. Dafür stehen uns humanmedizinische Standardgeräte (Primus und Titus A, Dräger), ein MRT-kompatibles Inhalationssystem (Servo 900D, Siemens) sowie hochpräzise Perfusionspumpen (Perfusor® compact S, Braun Melsungen AG) zur Verfügung. Darüber hinaus werden die Tiere durch ein weitreichendes prä-, intra- und postoperatives Monitoring überwacht.

Bildgebende Untersuchung mit klinischen Scannern und deren Auswertung

3D-Rekonstruktion von Haut und Knochen eines Schafkopfs basierend auf einem CT-Datensatz
© Foto Fraunhofer IZI

3D-Rekonstruktion von Haut und Knochen eines Schafkopfs basierend auf einem CT-Datensatz.

Zusammen mit unseren Partnern an der Universität Leipzig und der Arbeitsgruppe Experimentelle Bildgebung sind modernste Bildgebungstechniken für das Großtiermodell Schaf etabliert. Durch anatomische (Computertomographie (CT)) und anatomisch-funktionelle (Magnetresonanz-Tomographie (MRT)) Untersuchungen an der Klinik und Poliklinik für Diagnostische und Interventionelle Radiologie, Abteilung Neuroradiologie (Prof. K.-T. Hoffmann) sind Veränderungen nach Schlaganfall spezifisch feststellbar. Darüber hinaus können Stoffwechselvorgänge mittels Positron-Emission-Tomographie an der Klinik und Poliklinik für Nuklearmedizin (Prof. H. Barthel) visualisiert werden. Verschiedenste quantifizierende Auswerteroutinen erlauben eine exakte Beurteilung der Veränderungen.

DNA-RNA-Isolierung

RNA und DNA können aus allen kernhaltigen Zellen isoliert und aufbereitet werden. Hierbei stehen verschiedenste Isolationsmethoden zur Verfügung, welche beliebig an die verschiedensten Fragestellungen angepasst werden können. Anschließend werden die aufbereiteten Nukleinsäuren für Genexpressionsanalysen verwendet.

Experimentelle zerebrale Ischämie

Chirurgisch induzierter Schlaganfall in Schaf
© Foto Fraunhofer IZI

Chirurgisch induzierter Schlaganfall in Schaf.

Für die Entwicklung neuer Therapieansätze und die Erforschung pathophysiologischer Prozesse sind geeignete Krankheitsmodelle notwendig. Die Arbeitsgruppe verfügt, durch die Okklusion der mittleren zerebralen Arterien (MCAO), über ein permanentes, transkranielles Modell im Schaf, um eine zerebrale Ischämie zu simulieren. Je nach Lokalisation des Verschlusses (1-Ast, 2-Ast, totale MCAO) führt die Unterbrechung der Blutversorgung zu einem geringgradig bis mittelgradig, lokal begrenzten Schlaganfall.

Exzitotoxizitätsbestimmungen und Viabilitätstests

Die Auswirkungen von Substanzen in zellulären Testsystemen werden mittels Vitalitäts- und Toxizitätsassays (LDH-, MTT-Assay) evaluiert. Die Messparameter der photometrischen Tests dienen als Read-out System, um den Grundzustand der Zellen abzubilden.

Histologische und immunhistochemische Färbungen

Immunhistochemische Färbung von Astrozyten (grün) und Zellkernen (blau) im Schafgehirn
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Immunhistochemische Färbung von Astrozyten (grün) und Zellkernen (blau) im Schafgehirn.

Die Arbeitsgruppe weist langjährige Erfahrungen mit Gefrier- und Paraffinschnitten auf. Auf verschiedenen Geweben kann die gesamte Bandbreite histologischer und immunhistochemischer Färbungen durchgeführt werden.

Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie

Die qualitative und quantitative Analyse von fluoreszenzgefärbten Proben mit einem konfokalen Mikroskop (Zeiss LSM710) wird durch Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Experimentelle Bildgebung gewährleistet. Diese Mikroskoptechnologie erlaubt die überlappungsfreie Aufnahme von spezifischen Signalen in Geweben oder Zellkulturen. Für die Nachbearbeitung und 3D-Bildanalyse wird die Bildakquise durch das komplexe Softwarepaket Imaris ergänzt.

Kultivierung, Differenzierung und Charakterisierung von multipotenten Zellpopulationen und Progenitorzellen für zelltherapeutische Anwendungen

Zur Evaluierung der zelltherapeutischen Anwendbarkeit von multipotenten Zellpopulationen und Progenitorzellen werden Proliferations- und Differenzierungsprotokolle standardmäßig auf verschiedene Zellsysteme angepasst und durchgeführt. Derzeit werden verschiedene Proliferationsassays ebenso durchgeführt wie die Differenzierung neuraler Progenitoren zu Neuronen und Glia.

Molekularbiologische Analyse

Der zu untersuchende Abschnitt der DNA kann mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) vervielfältigt und analysiert werden. In verschiedenen Geweben oder zellulären Testsystemen können so genetische oder krankheitsbedingte Veränderungen ebenso wie Reaktionen auf Einflussfaktoren entschlüsselt und dargestellt werden.

Potenzielle Wirkmechanismen einer zellbasierten Therapie werden z.B. durch die Erstellung von Transkriptions- (qRT-PCR) sowie Proteinexpressionprofilen (SDS-Page / Western Blot) analysiert.

Neurochirurgische Operationen und Monitoring

Die chirurgischen Eingriffe erfolgen unter sterilen Kautelen
© Foto Fraunhofer IZI

Die chirurgischen Eingriffe erfolgen unter sterilen Kautelen.

Für die Untersuchung therapeutischer Effekte im Großtier etablierten wir ein transkranielles MCAO-Modell im Schaf. Durch die sensitiven Operationstechniken sind Langzeituntersuchungen über mehrere Wochen möglich. Darüber hinaus werden verschiedene neurochirugische Operationstechniken beherrscht. Die Arbeitsgruppe verfügt über ein weitreichendes Instrumentarium für Neuro- und Weichteilchirurgie inklusive chirurgischem Bohrsystem (microspeed® uni, Aesculap) und Elektrochirurgie (KLS Martin). Zusätzlich erfolgt eine permanente  Überwachung der Körperfunktionen (EKG, Sauerstoffsättigung, expiratorisches CO2, Körpertemperatur, arterieller Blutdruck (invasiv oder nicht-invasiv) sowie punktuelle Kontrolle der arteriellen Blutgase).

Proteinbiochemische Nachweisverfahren

Die weitere Untersuchung von post-ischämischen Regulationsmechanismen wird mittels Immunfluoreszenzfärbungen und FACS-Analysen realisiert. Außerdem kommen Proteincharakterisierungen durch Immunpräzipitation und Westernblot zum Einsatz. Diese Methoden ermöglichen quantitative und qualitative Zell- und Proteinanalysen mit Hilfe spezifischer Antikörper.

Verhaltensphysiologische Untersuchungen

Die Überprüfung des Therapieerfolgs in einem Schlaganfallmodel ist unter anderem auf die Quantifizierung funktioneller Defizite angewiesen. Hierzu wurde in der Arbeitsgruppe ein sensomotorischer Verhaltenstest für Schafe entwickelt. Dieser ist an den neurologischen Untersuchungsgang von Hunden angelehnt. Die Veränderungen werden per Video dokumentiert und verblindet ausgewertet.

Stereotaktische Eingriffe im Großtier

Präoperative Planung der stereotaktischen Zugänge am Computer
© Foto Fraunhofer IZI

Präoperative Planung der stereotaktischen Zugänge am Computer.

Lokale, minimal-invasive Eingriffe mit geringster Beeinträchtigung des Gehirns basieren auf modernsten Bildgebungstechniken mit Computertomographie oder Magnetresonanz-Tomographie. Ein spezielles stereotaktisches System (Brainsight®) für Großtiere erlaubt die präzise und sichere Neuronavigation vergleichbar denen im Menschen.

Referenzprojekt: Autologe Knochenmarktransplantation nach Schlaganfall im Großtiermodell

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Unlängst gelang die Etablierung eines Therapieprotokolls für den ischämischen Schlaganfall auf Basis stammzellhaltiger Knochenmarkspopulationen. Nach erfolgreichen Vorversuchen in unseren Rattenmodellen wurde das Therapieprotokoll auf das Großtier übertragen. Im Schaf erfolgte 24 Stunden nach Induktion eines ischämischen Infarkts durch permanenten Verschluss der mittleren Hirnarterie die Therapie durch intravenöse Gabe autologer Knochenmarkzellen. Eine engmaschige verhaltensphänotypische und bildgebende Überwachung unter Nutzung modernster Untersuchungsroutinen mittels Magnetresonanz- und Positronenemissionstomografie belegten dabei einen Therapieerfolg (Minderung von Infarktgröße und Funktionsausfällen), der später histologisch bestätigt werden konnte. Die Bildgebung wurde mit Partnern an der Universität Leipzig durchgeführt.

Externe Partner
Abteilung für Nuklearmedizin, Universitätsklinikum Leipzig
Abteilung Neuroradiologie, Universitätsklinikum Leipzig
Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig
Vita 34

Steigerung der zerebralen Blutversorgung nach ischämischem Schlaganfall

Coronal (links), sagitale (Mitte) und transversale (rechts) Aufnahmen eines Schafgehirns mit 3D T1 MRT (oben) und 15O-H2O PET (mitte) sowie die überlagerten Aufnamen (unten).
© Foto Fraunhofer IZI

Coronal (links), sagitale (Mitte) und transversale (rechts) Aufnahmen eines Schafgehirns mit 3D T1 MRT (oben) und 15O-H2O PET (mitte) sowie die überlagerten Aufnamen (unten).

Trotz der Einrichtung von spezialisierten Einheiten in Krankenhäusern (stroke units) bleiben nach einem Schlaganfall für die Rettung von verbliebenem Hirngewebe (Penumbra) nur wenige Stunden. Durch die selektive Steigerung der zerebralen Blutversorgung könnten die zerebralen Schäden vermindert werden. Unter praxisnahen Bedingungen wurde daher ein inhalatives Neuroprotektivum am Großtier Schaf getestet. Nach Verschluss der mittleren Hirnarterie in erwachsenen Tieren entwickelte sich ein Schlaganfall. Innerhalb der darauffolgenden 4,5 Stunden erfolgte eine funktionelle Verlaufsuntersuchung der zerebralen Blutversorgung mit und ohne Therapie durch modernste Bildgebung (Positronen-Emissions-Tomographie und Magnet-Resonanz-Tomographie) zusammen mit unseren Kooperationspartnern. Es konnte gezeigt werden, dass während der Inhalation mit dem Neuroprotektivum der zerebrale Blutfluss in der Penumbra selektiv gesteigert und damit das potenziell rettbare Hirngewebe vergrößert werden kann.

Externe Partner
Abteilung für Nuklearmedizin, Universitätsklinikum Leipzig
Abteilung Neuroradiologie, Universitätsklinikum Leipzig
Walter-Brendel-Zentrum für Experimentelle Medizin, Universität München
Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig

Markierung und Relokalisation von ovinen mesenchymalen Stammzellen mittels Very Small Superparamagnetic Iron oxide particles (VSOP)

Eisenfärbung mit Berliner-Blau Methode (links) und 3T MRT (rechts)
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Eisenfärbung mit Berliner-Blau Methode (links) zeigt die Inkooperation der VSOP-Partikel (blau) in die ovinen MSC (rot, Gegenfärbung mit Eosin). Diese führen im 3T MRT (rechts) zu einer umschriebenen Signalauslöschung (roter Kreis).

In verschiedenen präklinischen Studien konnte die Effektivität einer Transplantation mesenchymaler Stammzellen (MSC) nach Schlaganfall gezeigt werden. Kenntnisse hinsichtlich der Wirkungsweise dieser therapeutischen Option sind jedoch bis heute limitiert. In der vorliegenden Studie wurde daher für MSC aus Schafen ein Markierungsprotokoll mit VSOP entwickelt, mit dem Ziel, die autolog transplantierten Stammzellen im lebenden Organismus mit Hilfe der Magnet-Resonanz-Tomographie (MRT) zu lokalisieren. Nach Bestimmung der Vitalität und Markierungsintentsität wurden in Schafen verschiedene Mengen an VSOP markierten Stammzellen stereotaktisch, intrazerebral transplantiert und die Grenze der Nachweisbarkeit mittels 3T MRT (Siemens) sowie histologischen Methoden bestimmt. Im weiteren Versuchablauf werden die autologen, mit VSOP markierten MSC aus Knochenmark nach Schlaganfall eingesetzt, um deren Migrationsverhalten unter pathologischen Bedingungen zu untersuchen.

Externe Partner
Abteilung Neuroradiologie, Universitätsklinikum Leipzig
Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig
Institut für analytische Chemie, Universität Leipzig
Institut für Diagnostische Radiologie und Neuroradiologie, Ernst Moritz Arndt Universität Greifswald
Institut für Neurowissenschaften, Technische Universität München

Schlaganfalltherapie mit NSC: Untersuchungen im Großtiermodell

Darstellung der Fasern des Gehirns (T1 MRT) nach Schlaganfall durch Fibertracking im 3D rekonstruierten Gehirn
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Darstellung der Fasern (rot, DTI MRT) des Gehirns (T1 MRT) nach Schlaganfall (helle Bereiche, DWI MRT) durch Fibertracking im 3D rekonstruierten Gehirn.

Ziel des Versuchsvorhabens ist es, die Effektivität von neuronalen Stammzellen (die vor dem Stichtag 2007 gewonnen wurden) nach zerebraler Ischämie im Großtiermodell Schaf unter Berücksichtigung relevanter Mechanismen im Zeitverlauf zu überprüfen. Vor dem Hintergrund einer angestrebten humanmedizinischen Anwendung in der Regenerativen Medizin wurden diese GMP-konform hergestellten Zellen der humanen neuralen Zelllinie gemäß den Kriterien der Food and Drug-Association (FDA, USA) unter GMP-Konditionen von der Arbeitsgruppe um den Neurochirurgen Prof. Gary Steinberg in Stanford (Palo Alto, Kalifornien, USA) in verschiedenen Kleintiermodellen charakterisiert. Das Projekt soll die Fragestellungen der therapeutischen Effizienz einer lokalen, neuralen Stammzelltransplantation im Großtiermodell Schaf eruieren, die Sicherheit der Anwendung nach lokaler Applikation auch über lange Zeiträume im gyrenzephalen Gehirn überprüfen und die Umsetzbarkeit eines individualisierten (d.h. speziell für das vorliegende Infarktbild) zugeschnittenen Behandlungsprotokolls durch (stereotaktischen) Applikation der Zellen validieren.

Externe Partner
Stanford University, Kalifornien, USA
Translationszentrum für Regenerative Medizin (TRM) Leipzig, Universität Leipzig
Abteilung für Nuklearmedizin, Universitätsklinikum Leipzig
Abteilung Neuroradiologie, Universitätsklinikum Leipzig
Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig

Evaluierung eines Ultraschallverfahrens zur Diskriminierung von akuten zerebralen Ischämien und Hirnblutungen im Schafmodell

T2-gewichtete MRT-Aufnahme einer Hirnblutung in der rechten Hemisphäre
© Foto Fraunhofer IZI

T2-gewichtete MRT-Aufnahme einer Hirnblutung in der rechten Hemisphäre. Diese dient neben dem Ischämiemodell als Referenzobjekt für den Ultraschall.

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Die derzeit einzig anerkannte Therapieoption eines ischämischen Schlaganfalls bietet die Rekanalisation der verlegten Gefäße mittels Thrombolyse durch rtPA-Applikation. Der dafür zur Verfügung stehende Behandlungszeitraum ist auf 4,5 Stunden begrenzt, was die Erfolgschancen der Thrombolyse stark limitiert.

Neben der allgemeinen Diagnostik eines Schlaganfalls muss eine genaue Charakterisierung zum Ausschluss einer Hirnblutung (strenge Kontraindikation) stattfinden. Gegenwärtig ist dazu eine zeitaufwendige Bildgebung (u.a. MRT, CT) notwendig, die meist nur in spezialisierten Kliniken zur Verfügung steht.

Ein neuartiges Ultraschallverfahren soll im Großtiermodell evaluiert werden, um im Akutstadium am Patienten eine eindeutige und schnelle Differentialdiagnose zu ermöglichen. Nach Bestimmung der Sensitivität und Effektivität des zu prüfenden Verfahrens soll deren sichere Anwendung dargestellt werden.

Das im eigenen Hause vorhandene Schlaganfallmodell am Schaf dient als Grundlage der Studie. Zur schonenden Umsetzung eines Blutungsmodells wurde eine MRT-basierte Stereotaxie-Technik etabliert. Eine im Vorfeld durchgeführte Machbarkeitsstudie belegt bereits die Eignung der gewählten Modelle und Verfahren.

Externer Partner
SONOVUM AG

  • Cleveland Clinic, Department of Neurological Surgery
  • Lake Bioscience
  • Sonovum AG, Leipzig, Deutschland
  • Stanford University, Department of Neurosurgery
  • Universität Greifswald, Klinik für Neurologie
  • Universität Leipzig, Ambulatorische und Geburtshilfliche Tierklinik
  • Universität Leipzig, Chirurgische Tierklinik
  • Universität Leipzig, Institut für Medizinische Informatik, Statistik und Epidemiologie
  • Universität Leipzig, Institut für Veterinär-Pathologie
  • Universität Leipzig, Klinik für Neurologie
  • Universität Leipzig, Klinik für Nuklearmedizin
  • Universität Leipzig, Klinik für Radiologie
  • Universität Leipzig, Paul-Flechsig-Institut für Hirnforschung
  • Universität Leipzig, Translationszemtrum für Regenerative Medizin (TRM) Leipzig
  • Universität Leipzig, Veterinär-Anatomisches-Institut
  • Universitätsklinikum Carl-Gustav-Carus, Abteilung für Neuropathologie
  • Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz, Institut für Mikroskopische Anatomie und Neurobiologie, Research Group Molecular Imaging and Optogenetics
  • VITA 34 International AG

Publikationen

  • Hoffmann A, Stoffel MH, Nitzsche B, Lobsien D, Seeger J, Schneider H, Boltze J. The ovine cerebral venous system: comparative anatomy, visualization, and implications for translational research. PLoS One. 2014 Apr 15;9(4):e92990. DOI dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0092990.
  • Dreyer A, Stroh A, Pösel C, Findeisen M, von Geymüller T, Lobsien D, Nitzsche B, Boltze J. Frameless Stereotaxy in Sheep - Neurosurgical and Imaging Techniques for Translational Stroke Research. In: Balestrino M, Hrsg. Advances in the Preclinical Study of Ischemic Stroke. 1. Aufl. InTech; 2012. p. 21-46.
  • Boltze J, Nitzsche B, Geiger KD, Schoon HA. Histopathological investigation of different MCAO modalities and impact of autologous bone marrow mononuclear cell administration in an Ovine stroke model. Translational Stroke Research 2 (2011), 3, S.279-293. DOI dx.doi.org/10.1007/s12975-011-0101-5
  • Terpolilli NA, Kim SW, Thal SC, Kataoka H, Zeisig V, Nitzsche B, Klaesner B, Zhu C, Schwarzmaier S, Meissner L, Mamrak U, Engel DC, Drzezga A, Patel RP, Blomgren K, Barthel H, Boltze J, Kuebler WM, Plesnila N. Inhalation of nitric oxide prevents Ischemic brain damage in experimental stroke by selective dilatation of Collateral Arterioles. Circ Res. 2011 Dec 29. DOI dx.doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.111.253419 [Epub ahead of print]
  • Zscheile C. Bildgebende anatomisch-funktionelle Charakterisierung der fokalen zerebralen Ischämie im Zeitverlauf am Schaf. [Diplomarbeit Pharm.] Greifswald, Ernst-Moritz-Arndt Universität; 2011.
  • Mühle A, Mühle C, Amann K, Dötsch J, Nüsken KD, Boltze J, Schneider H. No juvenile arterial hypertension in sheep multiples despite reduced nephron numbers. Pediatr Nephrol. 25 (2010), 9, S. 1653-61.
  • Yerebakan C, Klopsch C, Niefeldt S, Zeisig V, Vollmar B, Liebold A, Sandica E, Steinhoff G. Acute and chronic response of the right ventricle to surgically induced pressure and volume overload - an analysis of pressure-volume relations. Interact Cardiovasc Thorac Surg. 10 (2010), 4, S. 519-25.
  • Stroh A, Boltze J, Sieland K, Hild K, Gutzeit C, Jung T, Kressel J, Hau S, Reich D, Grune T, Zimmer C. Impact of magnetic labeling on human and mouse stem cells and their long-term magnetic resonance tracking in a rat model of Parkinson disease. Mol Imaging, 8 (2009), 3, S. 166-78.
  • Yerebakan C, Sandica E, Prietz S, Klopsch C, Ugurlucan M, Kaminski A, Abdija S, Lorenzen B, Boltze J, Nitzsche B, Egger D, Barten M, Furlani D, Ma N, Vollmar B, Liebold A, Steinhoff G. Autologous umbilical cord blood mononuclear cell transplantation preserves right ventricular function in a novel model of chronic right ventricular volume overload. Cell Transplant, 18 (2009), 8, S. 855-68.
  • Boltze J, Förschler A, Nitzsche B, Waldmin D, Hoffmann A, Boltze CM, Dreyer AY, Goldammer A, Reischauer A, Härtig W, Geiger KD, Barthel H, Emmrich F, Gille U. Permanent middle cerebral artery occlusion in sheep: a novel large animal model of focal cerebral ischemia. J Cerebr Blood F Met 28 (2008), 12, 1951-64.
  • Förschler A, Boltze J, Waldmin D, Gille U, Zimmer C. MRI of experimental focal cerebral ischemia in sheep. Rofo 179 (2007), 5, S. 516-24.