Liganden-Entwicklung

Coronaviren begleiten die Säugetiere schon sehr lange Zeit. Mindestens vier verschiedene endemische Coronaviren zirkulieren in Menschen und haben ihre Spuren im Immunsystem hinterlassen. Daher zielen diese Arbeiten nicht allein auf die Identifizierung von Epitopen, die von Antikörpern in SARS-CoV-2 erkannt werden, sondern auch auf ihre endemischen Verwandten. Mit der »Epitop-Fingerprinting«-Methode können auch kleine Unterschiede der von Antikörpern erkannten Aminosäuresequenz der teilweise sehr ähnlichen Virusproteine berücksichtigt werden. In der Tat fanden die Analysen neben SARS-CoV-2-spezifischen Epitopen auch sehr ähnliche Antikörper in Seren nach Infektion mit Erkältungskrankheiten von vor 2020, aktuellen COVID-19-Infektionen und nach Impfung. Eine große Zahl solcher Epitop-Peptide wurde synthetisiert, mit einer speziellen Technik als Arrays auf Objektträger gedruckt und mit über 1 000 Serum­proben getestet. An Peptid-Spots gebundene Serumantikörper konnten über eine Fluoreszenz-Markierung, anschließendes Scannen im Laserscanner und mittels einer im Rahmen des Projekts neu entwickelten robusten automatisierten Analyse der erhaltenen Bilder auch quantitativ sehr einfach erfasst und ausgewertet werden. Nur dank dieser Entwicklung konnte eine so große Zahl von Messungen rasch und zuverlässig ausgewertet werden.

Durch Korrelation der Ergebnisse von allen drei verschiedenen klinischen Gruppen wurden zahlreiche Antikörper gegen das S-Protein und die RNA-Polymerase gefunden, die ihren Ursprung in früheren Infektionen mit endemischen Viren haben und teilweise schon vor der Impfung bzw. unmittelbar nach der SARS-CoV-2-Infektion im Serum zirkulieren. Überraschenderweise erkennen einige kreuzreagierende Antikörper auch Epitope im S-Protein, die sich zwar in der Sequenz aber kaum in der Struktur unterscheiden (Abb. 1).

Diese und andere Epitope können in der Zukunft helfen, nicht nur global Antikörper an einem Protein, sondern auch spezifisch einzelne Antikörper und damit die individuell sehr verschiedenen Immunantworten auf COVID-19 und Impfstoffe nachzuverfolgen.

Serologische Diagnostik für COVID-19 wird gegenwärtig nur auf Basis von Proteinen angeboten. Neben überraschend falsch positiven Ergebnissen werden aus der klinischen Diagnostik vor allem Probleme durch Vorerkrankungen mit verwandten Corona­viren vermeldet. Die Erkennungsstellen der Patient*innenantikörper (Epitope) sind nämlich nur teilweise spezifisch für SARS-­CoV-­2, während sich andere auf vielen verwandten Coronaviren wiederfinden.

Es war daher notwendig, die serologischen Tests auch auf Basis von definierten Epitopen von SARS-­CoV-­2 bzw. anderen Corona­viren aufzubauen, die mit Hilfe verschiedener spezifischer und ubiquitärer Epitope eine ebenso einfache wie hochgradig individualisierte Diagnostik erlauben. Am Fraunhofer IZI verfügt die Arbeitsgruppe Liganden-Entwicklung über umfangreiche Erfahrungen mit der Identifizierung von Epitopen direkt aus Seren. Es zeigt sich bereits in dieser Studie, dass es bei SARS-CoV-2-Infektionen zu einer stark personalisierten Immunantwort geprägt durch frühere Corona-Infektionen kommt.

Bei allen diagnostischen Arbeiten werden die Seren aus infizierten Patienten*innen aber zur Virusinaktivierung vorbehandelt, bevor sie in den Tests eingesetzt werden können. Im Rahmen von CoV-tot konnte nachgewiesen werden, dass verschiedene Methoden zur Virusinaktivierung einen sehr unterschiedlichen Einfluss auf verschiedene Antikörper in den Seren haben. Dies kann im Einzelfall zu ganz unterschiedlichen Ergebnissen bei serologischen Untersuchungen führen. Darüber hinaus haben die Studien ergeben, dass eine leichte Denaturierung der Probe die Blockierung einzelner Antikörper durch unbekannte Serumbestandteile aufzuheben scheint.

Dadurch können bessere Ergebnisse erzielt werden. Zwei Methoden der Virus­inaktivierung konnten als geeignet identifiziert werden, zum einen die Erhitzung auf 56 Grad Celsius für zehn Minuten bei flüssigen Proben und zum anderen die Behandlung mit 70 % Ethanol, wenn die Antikörper immobilisiert an Protein A vorliegen.

Die im Rahmen von CoV-tot gewonnenen Erkenntnisse waren ein Startpunkt zur Erforschung von Unterschieden im Krankheits­verlauf auch in Zusammenhang mit klinischen Studien zur medikamentösen Behandlung von COVID-19.

Partner
Klinikum St. Georg, Leipzig

Förderung
Gefördert im Rahmen der Internen Programme der Fraunhofer-Gesellschaft, Fördernummer Anti-Corona 131-600034.

Die Immundiagnostik von Krankheiten beruht zurzeit in der Regel auf Proteinen oder Extrakten, die direkt aus den pathogenen Organismen oder biotechnologisch hergestellt werden. Der Nachteil ist, dass Varianten, wie sie zum Beispiel bei Grippe­viren vorliegen, nur schwer unterschieden werden können. Es konnten Verfahren zur exakten Identifikation der Bindungsstellen von Patient*innen-Antikörpern (Epitopen) ent­wickelt werden, die auch direkt in Seren Anwendung finden können. Das erlaubt die zuverlässige Identifizierung des Erregers, des ursächlichen Antigens bei einer Allergie oder vielen Indikationen wie (Auto)Immun- und Infektionskrankheiten sowie neue Therapie- und Forschungsansätze.

Lebensmittelallergien sind seit vielen Jahren ein Forschungsschwerpunkt der Arbeitsgruppe Liganden-Entwicklung. Eine stetige Zunahme gerade dieser Erkrankungen ist in den letzten Jahren zu beobachten. Diagnosen mit Haut-Pricktest sind nur begrenzt hilfreich, da vor allem viele Pflanzenproteine sehr ähnlich in ihrem Aufbau sind. Eine epitopbasierte Diagnostik ist wahrscheinlich die einzige Alternative zu aufwendigen klinischen Unter­suchungen. Diese setzen in der Regel eine Blutentnahme voraus, wobei einzig die Provokation mit den Lebensmitteln, die stationär und unter ärztlicher Beobachtung in einer Klinik durchgeführt werden muss, bisher als sicherer Beweis einer Allergie gilt. Eine effiziente Diagnose, geeignete Behandlung und Anpassung der Ernährung ist daher bei vielen Patient*innen kaum möglich.

In einem ersten Projekt am Beispiel der Sojaallergie wurde gezeigt, dass tatsächlich einige wenige Epitope zur sicheren Identifikation von sensibilisierten Personen und auch solchen mit klinischen Symptomen ausreichen könnten. Diese Peptide sollen zukünfig in einem einfachen Test zum Einsatz kommen, der entsprechende Antikörper auch in einem Blutstropfen nachweisen könnte. Dies wäre ebenso ein Modell für Tests auf Infektionskrankheiten, die Effizienz von Impfstoffen oder Autoimmunerkrankungen.

Ein besonders umfangreiches Projekt wird von der Fraunhofer-Zukunftsstiftung gefördert, das auch national und international von Allergolog*innen mit großem Interesse verfolgt wird. In Kooperation mit mehreren anderen Fraunhofer-Instituten und Kliniken wird im Projekt FoodAllergen an einem holistischen Ansatz zum Umgang mit Lebensmittelallergien geforscht. Dieser umfasst auch die Identifizierung der Allergene in Lebensmitteln sowie neue Verfahren zu Herstellung von Lebensmittelzutaten mit reduziertem allergenen Potenzial. Es wurden inzwischen die Epitope für verschiedenste Pflanzen­allergene in Nahrungsmitteln identifiziert. Eine Umsetzung in Tests für Patient*innen ist in Vorbereitung.

In einem gemeinsamen Projekt mit dem Fraunhofer IFAM wurde entdeckt, dass eine einfache, mit zellbiologischen Verfahren kompatible Enzymreaktion genutzt werden kann, um Peptidliganden kovalent an ihre Rezeptoren auf Zellen zu binden. Daraufhin initiierten beide Institute das von der Fraunhofer-Gesellschaft geförderte Projekt ZELLFIX, um die gleiche Reaktion zur Modifikation von Oberflächen einzusetzen.

Zellen haften ungern auf den Polymeren von Kulturschalen. Normalerweise werden Polystyroloberflächen mit Plasma behandelt, was aber auch zu unerwünschten, teilweise toxischen Nebenprodukten führt. Mit dem neuen Verfahren könnten zum einen Peptid- und Proteinliganden die Anheftung der Zellen verbessern und zum anderen einzelne Oberflächenproteine kovalent direkt an die Platten gebunden werden, wie dieses auch auf plasmaaktivierten Oberflächen geschieht.

Im Projekt ZELLFIX wurden zunächst die ursprünglichen Annahmen experimentell bestätigt. Sogar abgegrenzte Bereiche von Zellkulturschalen lassen sich mit geringem Aufwand so modifizieren, dass Zellen nur dort anhaften. Diese Methode ist auch geeignet, um die lokale Anheftung von Proteinen selbst bei handelsüblichen, bereits plasmaaktivierten, Oberflächen zu verbessern.

Diese Verfahren werden bereits mit Partnern aus Industrie und Fraunhofer-Gesellschaft für erste spezielle Anwendungen erprobt. Zudem konnten über den biologischen und medizinischen Bereich hinaus zusätzlich neue Anwendungen identifiziert werden.