Tumorstammzellen

Ziel der Arbeitsgruppe ist die Entwicklung von zell- und wirkstoffbasierten Therapiestrategien zur Behandlung neoplastischer Erkrankungen auf der Grundlage der Elimination oder Modifikation von Tumorstammzellen (TSZ) des entsprechenden Malignoms. Mit diesem Konzept sollen TSZ von weiteren Tumorentitäten beschrieben und therapeutische Innovationen im Bereich der internistischen Onkologie ermöglicht werden.

»Colony forming cell assay« (CFCA) von Tumorzellen und -stammzellen

Zeitabhängige Bildung von Tumorstammzellsphären in einem neuen kollagenbasierten »Colony forming cell assay« (CFCA)
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Zeitabhängige Bildung von Tumorstammzellsphären in einem neuen kollagenbasierten »Colony forming cell assay« (CFCA).

Das Generieren von Tumorsphären ist eine der gebräuchlichsten Methoden zur Isolierung, Expansion und Charakterisierung von Tumorstammzellen. Dieses serumfreie Kultivierungssystem wurde auch zur Expansion von Stammzellen und der Bestimmung ihrer Frequenz in einer Vielzahl von normalen Geweben verwendet. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass eine direkte Korrelation zwischen der Bildung einer Tumorsphäre und dem Auftreten eines Malignoms besteht.

Wir benutzen einen kollagenbasierten, semisoliden Assay, den »Tumor-colony forming cell assay« (T-CFCA), mit welchem man Tumorzellen mit Stammzelleigenschaften – aufgrund ihres »long-term proliferative« Potenzials – zu diskriminieren in der Lage ist.

Immunphänotypisierung und FACS – Separation von Tumorstammzellen

Durchflusszytometrische Charakterisierung und Reanalytik der Tumorstammzellfraktion einer primären humanen Mamma-CA-Zelllinie
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Durchflusszytometrische Charakterisierung und Reanalytik der Tumorstammzellfraktion einer primären humanen Mamma-CA-Zelllinie.

Die Validierung einer Stammzellidentifikation in einem Malignom erfolgt durch eine immunphänotypische Charakterisierung von Stammzelleigenschaften der Tumorzellen der entsprechenden Probe über die FACS-Analyse. Dabei werden die Zellen mit verschiedenen monoklonalen Antikörpern gegen tumor-, stammzell- und gewebsassoziierte Antigene markiert. Jeder dieser Antikörper ist mit einem partikularen Fluoreszenzfarbstoff konjugiert. Im Ergebnis erhält man eine Tumorstammzell- und eine Residualtumorzellfraktion, die sich aus der initialen Parentaltumorzellsuspension herleitet (Einzelzellsuspension).

Gerätepool

  • FACS »FC500« (Beckmann Coulter)
  • Zellsorter »MoFlo« (Beckmann Coulter)
  • MACS-Separator (Miltenyi)
  • EliSpot-Reader (AID)
  • Light Cycler (Roche)
  • 96-well Zellharvester (Wallac)
  • ß-Counter (Applied Biosystems)
  • Bioluminescence Imaging System (Caliper Xenogen IVIS Spektrum Imaging System)
  • Tiermodelle (es stehen luciferase-transgene NOD/SCID-Mausmodelle [RCC, Panc-CA, PCA, Ov-CA, Breast-CA] zur Tumorinduktion zur Verfügung)

Echtzeit-Monitoring des Tumor-Engraftments sowie einer Remission nach adjuvanter Therapie im luciferase-transgen basierten NOD / SCID-Mausmodell

Monitoring der Tumorinitiation und -remission nach Cisplatin-Kombinationstherapie
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Monitoring der Tumorinitiation und -remission nach Cisplatin-Kombinationstherapie.

Zur Untersuchung eines Überlebensvorteils bei adjuvanter Anti-Tumortherapie (z.B. Zytostatikum + small molecules) konnte eine Remission im NOD / SCID-Mausmodell für das Pankreaskarzinom dargestellt werden.

Den Tieren wurden am Tag 1 (d1) je 1x10E5 luciferase-transduzierte Zellen der Pankreaskarzinomlinie DAN-G in die Nackenfalte appliziert. Über die ersten 21 Tage erfolgte das Monitoring des Engraftments und der Tumorprogression. Am Tag 22 (d22) post application erfolgte der Beginn der adjuvanten Therapie (Cisplatin [8mg/ml] + Adjuvanz). Ab diesem Tag konnte eine Tumorremission in dem behandelten Tier dargestellt werden. Am Tag 29 (d29) erfolgte die zweite therapeutische Applikation, die zu einer weiteren Tumorremission bis zum Tag 36 (d36) führte. Die Untersuchung der Verlaufskontrolle wurde am Tag 29 (d29) aufgrund der erhöhten Tumorlast beendet.

Eine solche adjuvante Kombinationstherapie soll den Überlebensvorteil durch eine spezifische Tumorstammzellinhibition signifikant überbieten.

Entwicklung einer neuen epigenetischen Krebstherapie auf der Grundlage neu-synthetisierter, nicht-kovalenter DNMT-Inhibitoren

Die Entartung von gesunden Körperzellen zu bösartigen Krebszellen steht in engem Zusammenhang mit epigenetischen Veränderungen im Genom der Zelle. Dazu gehört die Hypermethylierung sogenannter Tumorsuppressorgene durch Enzyme mit der Bezeichnung DNA-Methyltransferasen (DNMT). Im Gegensatz zu genetischen Mutationen ist diese Form der Veränderung jedoch prinzipiell umkehrbar und daher ein vielversprechender Ansatz zur Entwicklung neuer Medikamente.

Das Projekt zielt daher auf Design, Synthese und pharmazeutische Entwicklung sogenannter DNA-Methyltransferase-Inhibitoren, die in den Stoffwechsel der Zellen eingreifen und die Hypermethylierung von Tumorsupressorgenen gezielt verhindern sollen. Neben einem speziell entwickelten Tiermodell und modernen Bildgebungsverfahren kommen im Rahmen der Entwicklung auch Tumorstammzellen (TSZ) zum Einsatz.

Tumorstammzellen gelten als Keimzelle für die Entstehung und das Wachstum von Tumoren. Sie verfügen über die typischen Eigenschaften von Stammzellen, wie der Fähigkeit zur Selbsterneuerung und einem hohen Differenzierungspotenzial. Jüngere Studien lassen vermuten, dass die TSZ besonders resistent gegenüber den gängigen Therapieformen (Chemotherapie, Radiotherapie) sind und somit für Rückfälle und Metastasenbildung verantwortlich sind. Die Entwicklung von Therapiekonzepten, welche spezifisch auf die Eliminierung der TSZ abzielen, ist daher dringend notwendig. Die am Fraunhofer IZI etablierten Tumorstammzelllinien repräsentieren daher eine ideale Plattform für die pharmakologische Entwicklung.

Im Rahmen des Projekts sollen zunächst die DNMT-relevanten Zielmoleküle innerhalb der TSZ-spezifischen Signalwege identifiziert und charakterisiert werden. Die als optimal identifizierten DNMT-Inhibitoren werden anschließend in einer GLP-Studie anhand ausgewählter TSZ-Kompartimente im Tiermodell evaluiert. Die TSZ-abgeleitete Tumorinitiation sowie die DNMT-basierte Remission eines Malignoms können dabei durch Biolumineszenz-Imaging überwacht werden. Das moderne Bildgebungsverfahren erlaubt dabei die Beobachtung des gesamten Krankheits- und Therapieverlaufs innerhalb des Organismus.

In-vitro-Testung von Zytostatika an Tumorstammzellen

Sphäroidbildung von TSZ des Mamakarzinoms
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Sphäroidbildung von TSZ des Mamakarzinoms.

Bei der Entstehung verschiedener Krebsformen wird Tumorstammzellen (TSZ) eine maßgebliche Rolle zugesprochen. Sie besitzen die typischen Stammzelleigenschaften, wie Selbst­erneuerung und Differenzierungspotenzial. Derzeit wird davon ausgegangen, dass diese Zellpopulation resistent gegen verschiedene Therapieformen ist und sowohl zu Rückfällen als auch zur Metastasierung führt. Am Fraunhofer IZI wurde eine Testplattform entwickelt, welche eine schnelle und praxisnahe Untersuchung multipler Wirkstoffkandidaten zur Intervention gegen Tumorstammzellentitäten erlaubt. In vitro werden spezi­fische Tumorstammzellen Sensi­bilitätstestungen gegenüber neuen Wirkstoffkandidaten (z.B. Zytostatika) unterzogen. Im Einzelnen geht es dabei um dosisabhängige Kinetiken im Zusammenhang mit speziellen Bestrahlungs­regimen. Die Testplattform liefert in erster Instanz Wachstumskurven von Tumorstammzellen nach Wirkstoffexposition, die durch einen folgenden In-vivo-Ansatz, nach Tumorgenese im Mausmodell, komplettiert werden können.

  • Klinikum St. Georg gGmbh, akademisches Lehrkrankenhaus der Universität Leipzig, Robert-Koch-Klinik
  • RedHill Ltd.
  • RESprotect GmbH
  • St. Elisabeth-Krankenhaus Leipzig, akademisches Lehrkrankenhaus der Universität Leipzig, Brustzentrum
  • St. Elisabeth-Krankenhaus Leipzig, akademisches Lehrkrankenhaus der Universität Leipzig, Urologie
  • Universität Leipzig, Medizinische Fakultät
  • Universitätsklinikum Leipzig AöR, Klinik und Poliklinik für Augenheilkunde
  • Urologische Praxis Dr. Schulze
  • Quimatrix SME

  • Fricke S, Hilger N, Fricke C, Schönfelder U, Behre G, Ruschpler P, Boldt A, Oelkrug C, Sack U, Emmrich F. Prevention of graft-versus-host-disease with preserved graft-versus-leukemia-effect by ex vivo and in vivo modulation of CD4(+) T-cells. Cellular and Molecular Life Science. 2014 Jun;71(11):2135-48. DOI: dx.doi.org/10.1007/s00018-013-1476-0.
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