Nanotechnologie

Die Arbeitsgruppe befasst sich mit der Entwicklung molekulardiagnostischer Testsysteme für den Lebensmittel- und medizinisch-klinischen Bereich. Wesentliche Schwerpunkte sind die Entwicklung Teststreifen-basierter Schnelltests zum Nachweis von Infektionserregern, die bioanalytische Probenvorbereitung sowie die Applikation Nukleinsäure-bindender Proteine. Zwei neuartige Lab-on-a-Chip-Diagnostikplattformen, z.B. auf Basis funktionalisierter magnetischer Partikel, wurden zur schnellen Analyse von Patientenproben realisiert.

Hochintegrierte diagnostische Verfahren benötigen eine gezielte Probenaufbereitung. Im Rahmen der Projektgruppe Sample Preparation fokussieren wir uns auf kundenspezifische Verfahren zur Probenaufbereitung und Isolierung von Zielmolekülen aus komplexen Matrices.

  • Magnetpartikel-basierte Assays
  • Lab-on-a-chip-Technologie
  • BIAcore – Optische Biosensoren in der molekularen Diagnostik
  • Nanotoxikologie
  • Funktionelle Teststreifen
  • RNA-Interferenz
  • Reportergen-Assays
  • Proteinexpression und -aufreinigung

Probenvorbereitung

Probenvorbereitung
© Foto Fraunhofer IZI

Probenvorbereitung

Die Probenvorbereitung ist ein entscheidender Aspekt in vielen Bereichen der bioanalytischen Forschung, insbesondere in der Analyse komplexer Proben und/oder seltener, niedrig konzentrierter Zielmoleküle. Moderne Labors nutzen sehr empfindliche Nachweisverfahren, einschließlich der Molekulardiagnostik; jedoch hängt ihre Leistung stark von der Qualität der Probe ab. Für den wirksamsten Nachweis der Zielmoleküle muss die Probe analytisch vorbereitet werden. Das beinhaltet die Reinigung der Probe und ihre Vorkonzentration sowie parallel die Entfernung der Verbindungen, die die Analyse beeinträchtigen könnten. Das Konservieren von Proben, die den Abbau der Zielmoleküle verhindern, ist ebenso Aufgabe dieses Gebiets der angewandten Analytik. Das Hauptziel der Probenvorbereitung ist es, die Genauigkeit und Effizienz der nachfolgenden Analyse zu gewährleisten. Keiner der Ansätze zur Probenvorbereitung ist universell: Zu berücksichtigen sind stets die Verfahren zur Weiterverarbeitung der Probe, die Konzentration und Art, das Volumen der Probe und viele anderen Faktoren.

Heutzutage verfolgt die bioanalytische Forschung aktiv die Integration von komplexen Tests auf automatisierten Plattformen, darunter Lab-on-Chip-Geräte. Dieser Trend lässt oft intelligente Lösungen für die Schritte bei der Voranalyse und -behandlung vermissen. Das Ziel unserer Arbeitsgruppe ist es, diesen bestimmten Bereich durch die Entwicklung der am besten geeigneten Ansätze zur Probenvorbereitung für spezifische Bedürfnisse voranzubringen.

Die Gruppe unterstützt Forscher und Industriepartner mit maßgeschneiderten Lösungen, wertet Kapazitäten der bestehenden Methoden aus und entwickelt neue Strategien für die effektive Verarbeitung bei der Probenvorbehandlung.

Parodontitis-Chip

Probenentnahme für die schnelle Analyse parodontalpathogener Erreger mittels Parodontitis-Chip
© Foto Fraunhofer IZI

Probenentnahme für die schnelle Analyse parodontalpathogener Erreger mittels Parodontitis-Chip.

Parodontitis ist eine entzündliche Erkrankung des Zahnhalteapparats, die unbehandelt zum Zahnausfall führen kann. Allein in Deutschland wird prognostiziert, dass fast 12 Millionen Menschen von Parodontitis betroffen sind. Ursächlich wird die Parodontitis durch bakteriellen Plaque ausgelöst, der in einen Abbau des dentalen Knochengewebes münden kann. Intensiv untersucht wird ein systemischer Zusammenhang zwischen vorkommenden Parodontitis-Erregern und Herz-Kreislaufschädigungen, der schwerwiegende Erkrankungen wie Herz- oder Schlaganfälle auslösen könnte.

Ziel des Parodontitis-Chip-Projekts ist die Entwicklung einer vollintegrierten Diagnostikplattform sowohl für die schnelle Aufbereitung als auch der anschließenden Analyse von parodontal-pathogenen Erregern in komplexen Proben. Diese innovative Technologieplattform besteht aus einer kompakten mikrofluidischen Karte und einem kombinierten Aufreinigungsmodul, in denen die Arbeitsschritte der Isolation der Keime, gezielte Vervielfältigung der DNA-Sequenzen und deren Detektion ablaufen. Der Parodontitis-Chip soll dem Anwender die Möglichkeit geben, elf relevante Bakterien, die bei der Entstehung der Parodontitis eine wesentliche Rolle spielen, in einem integrierten, sogenannten Lab-on-a-chip-Format parallel nachzuweisen und zu charakterisieren. Zusätzlich erfolgt die Etablierung eines einfachen Meßsystems, das ein Monitoring der Reaktionskinetik ermöglichen wird. Damit soll eine Quantifizierung der Erreger sowie eine Bestimmung der Gesamtkeimzahl realisiert werden.

Mit dem Parodontitis-Chip entsteht eine einfache molekulardiagnostische Testplattform, die leicht auf verschiedene Fragestellungen im Bereich der medizinischen-, umwelt- oder Lebensmittelanalytik angepasst werden kann. Vereinfachte Lab-on-a-chip-Entwicklungen können durch einen extrem simplen Aufbau und der Integration berührungsfreier Detektionsverfahren zu einer deutlichen Zeit- und Kostenersparnis für den Anwender führen.

Beitrag zum Parodontitis-Chip im ARD Mittagmagazin, 12. März 2013

Entwicklung diagnostischer Teststreifensysteme

Einfache Teststreifensysteme zum schnellen Nachweis klinisch relevanter Parameter oder zur Qualitätssicherung von Lebensmitteln werden nicht nur in Entwicklungsländern immer wichtiger. Wir erarbeiten eine simple diagnostische Plattform, die sich besonders für nukleinsäure-basierte Formate eignet. Als Referenzassay werden pathogene Erreger in humanen Proben diagnostiziert.

TBSearch-Projekt

Tuberkulose ist eine Infektionskrankheit, welche durch Mycobacterium tuberculosis verusacht wird. Laut einem Bericht der WHO (World Health Organisation) aus dem Jahr 2013 ist Tuberkulose nach HIV die zweithäufigste Todesursache unter den Infektionskrankheiten.

Umso wichtiger ist es, frühzeitig eine zuverlässige Diagnose zu erstellen. Dazu entwickelt die Arbeitsgruppe derzeit gemeinsam mit der McMaster University in Hamilton (Kanada) ein Detektionssystem, welches den Anforderungen einer schnellen, einfachen und kostengünstigen Diagnose gerecht wird. Das Nukleinsäure-basierte Testsystem beinhaltet alle Schritte von der Isolierung des Erregers bis zur Nachweis der Hybridisierung der Ziel-Nukleinsäure an einer Erreger-spezifischen Sonde.

Schnelle Vor-Ort-Diagnose von Infektionskrankheiten auf Basis eines Lab-on-a-Chip-Systems

Mikrofluidische Karte als CAD-Modell (Computer Aided Design)
© Foto Fraunhofer IZM

Mikrofluidische Karte als CAD-Modell (Computer Aided Design).

magnetischer Nanopartikel auf mikrofluidischer Karte
© Foto Fraunhofer IZI

Steuerung magnetischer Nanopartikel durch eine im Rapid-Prototyping-Verfahren hergestellte mikrofluidische Karte unter Verwendung von Magneten, die ober- und unterhalb der mikrofluidischen Karte angeordnet sind.

Komplexe und lebensbedrohliche Infektionserkrankungen (z.B. Sepsis) können derzeit nur mit aufwändigen, zeitraubenden Verfahren unter Einschaltung eines Analyselabors und mit qualifizierten Fachkräften zuverlässig diagnostiziert werden. Die Gruppe entwickelt in Kooperation mit europäischen Partnern ein innovatives System zur schnellen, einfachen und kostengünstigen Infektionsdiagnostik direkt vor Ort.

Das System basiert auf magnetischen Partikeln im Mikrometermaßstab, die je nach Anwendungsbereich als Träger für Antikörper und krankheitsassoziierte DNA-Sequenzen funktionalisierbar sind. Diese Magnetpartikel werden auf einem scheckkartenähnlichen Disposable eingesetzt. Bei der Vor-Ort-Untersuchung wird dem Patienten eine Probe entnommen, etwa Blut, Speichel oder Urin, die dann in das Lab-on-chip-System integriert wird. Die Magnetpartikel binden nach Aufbruch der Zielzellen an die entsprechenden Zielmoleküle in der Probe und werden mit Magnetkraft vollautomatisch durch verschiedene Reaktionsgefäße transportiert. Am Ende der Prozesskette erfolgt die Diagnose mittels hochempfindlicher Magnetosensorik.

Das Projekt wird durch das Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) gefördert und durch die Magna Diagnostics GmbH, einer Ausgründung des Fraunhofer IZI, koordiniert.

Herstellung und Charakterisierung DNA-bindender Proteine

Eine Vielzahl verschiedener Proteine zeigen spezifische DNA-bindende Eigenschaften, die mit gezielten zellulären Funktionalitäten verknüpft sind. Wir nutzen Zinkfinger-Proteine, die definierte Nukleinsäuresequenzen binden und als immobilisierte Elemente eines Proteinarrays doppelsträngige DNA aus Probelösungen fangen können.

Des Weiteren fokussieren wir uns auf funktionelle Proteine, die Nukleinsäuren pathogener Erreger aus einem Überschuss humaner DNA isolieren können. Diese Proteine sollen Einsatz in neuartigen Aufreinigungsverfahren finden.

NoDope – Nachweis von Dopingmissbrauch

Seit Jahrzehnten versuchen Sportler eine Verbesserung ihrer körperlichen Leistungsfähigkeit durch die Einnahme verbotener und vielfach gesundheitsschädlicher Substanzen zu erreichen. Die illegalen Produkte befördern Ausdauer und Muskelaufbau und verbessern die körperliche Regeneration nach intensiven Trainingseinheiten oder Wettbewerben. Die signifikanten Gesundheitsrisiken, wie Schädigung der Blutgefäße oder Krebsentwicklung, werden dabei billigend in Kauf genommen.

Im Rahmen unserer Forschung soll ein diagnostisches Verfahren entwickelt werden, das den Nachweis von Dopingmitteln im Blut oder Urin ermöglicht. Eine vollständige Integration der Probenvorbereitung und des analytischen Bioassays soll auf Basis eines Schnelltests bzw. mit Hilfe der Oberflächenplasmonresonanz (SPR)-Technologie realisiert werden.

Referenzprojekt: Dielektrophoretische Verfahren zur markerfreien Isolation zirkulierender Tumorzellen

Zirkulierende Tumorzellen (CTC) sind Krebszellen, die, abgesondert von einem Tumorgewebe, im peripheren Blut nachweisbar sind. Deren Isolierung und Charakterisierung hat in der onkologischen Forschung als auch in der Diagnostik eine zunehmende Bedeutung. So verwenden bereits zugelassene Systeme die Anzahl der CTC im Blut als prognostische Marker für die sog. personalisierte Medizin. Die Isolation dieser Zellen stellt jedoch höchste Anforderungen an die Diagnostik, da die Konzentrationen dieser seltenen Zellen im Blut eines Patienten extrem niedrig ist. Im Unterschied zu Verfahren, die spezifische Oberflächenmarker von Krebszellen zur Isolation nutzen, verwenden wir die sog. ApoStream™ Technologie des amerikanischen Unternehmens ApoCell. Dieses Verfahren ermöglicht eine hochspezifische Isolation der CTC nur aufgrund ihres unterschiedlichen Verhaltens im dielektrophoretischen Feld. Um das System zu charakterisieren, entwickeln wir Surrogate – Ersatzstoffe für CTCs und PBMCs (Peripheral Blood Mononuclear Cells).

Referenzprojekt: Luciferase-basierte Reportergen-Assays für funktionelle Genomik und Drug Discovery

Reportergen-Assays sind in der modernen Forschung vielseitig verwendbar. Sie dienen vorrangig zur Charakterisierung regulatorischer Elemente (Promoter-Regionen) oder Modulatoren (Transkriptionsfaktoren) auf genomischer Ebene. Insbesondere Luciferase-basierte Reportergen-Assays sind heute in der biomedizinischen und pharmakologischen Forschung etabliert. Aufgrund der sehr niedrigen Nachweisgrenze konnten sie sich gegenüber fluoreszenzbasierten Reportergenen durchsetzen. Prinzipiell wird das zu untersuchende regulatorische, genetische Element vor ein Luciferase-Gen kloniert. Das Reportergenkonstrukt kann mittels herkömmlicher Transfektionsmethoden in ein ausgewähltes Zellsystem eingebracht werden. Die biologische Aktivität des klonierten genetischen Elements kann nun zeitabhängig charakterisiert werden. Das Fraunhofer IZI bietet ein komplettes Dual-Luciferase-System an, welches sich zur Untersuchung von genetischen, regulatorischen Elementen aus Säugetiergenomen eignet.

Methode

Die Methode beinhaltet drei Schritte:

  • Klonierung und Sequenzierung der Targetsequenz in das Reporterkonstrukt
  • Transfektion vom ausgewählten Zellsystem mit dem Reporterkonstrukt
  • Messung der biologischen Aktivität

optional:

  • Gabe von externen Stimulantien (z.B. Wirkstoffe) oder veränderte Kulturbedingungen (z.B. Hypoxie)
  • Generierung von Deletionsmutanten

Referenzprojekt

Im Rahmen einer kooperativen Arbeit mit der Abteilung Allgemeine Biochemie der Universität Leipzig konnte die Aktivität des humanen GLO1-Promoters in verschiedenen Karzinom-Zelllinien untersucht werden. Derzeit wird der Einfluss von Hypoxie auf die Promoteraktivität untersucht.

Ausgewählte Applikationen

Das System dient zur funktionellen Charakterisierung jedes erdenklichen regulatorischen Elements aus Säugergenomen. Zudem bietet das System die Möglichkeit zur Untersuchung von exogenen Faktoren in Kombination mit normalen oder veränderten Kulturbedingungen.

Referenzprojekt: RNA-Interferenz-basierte Tumormodelle für Substanz-Screening und Aufklärung von Wirkmechanismen potenzieller Wirkstoffe

RNAi ist ein konservierter Mechanismus, welcher die Genexpression auf posttranskriptioneller Ebene reguliert. In Eukaryoten wird doppelsträngige RNA (dsRNA) zu kurzen, kleinen interferierenden RNAs (siRNA) prozessiert, welche die Degradierung der komplementären mRNA zur Folge hat. Dies führt letztendlich zur effektiven Herabregulierung des spezifischen Proteins. Diese charakteristischen Eigenschaften führen zur Anwendung RNAi in Zellkulturen sowie in Tiermodellen. Die spezifische Unterdrückung der Genexpression und Proteinaktivität modelliert die pharmakologische Inhibierung des Zielproteins und ist daher ein effektives Werkzeug für proof-of-principle-Experimente sowie die Identifizierung und Validierung von antitumoralen Wirkstoffen.

Im Rahmen des Referenzprojekts soll ein bereits identifiziertes Zielprotein für eine neuartige Krebstherapie mit der Bezeichnung Glyoxalase I (GLO I) spezifisch durch RNAi stufenweise herabreguliert werden. Zudem soll das System die Möglichkeit bieten, die GLO1 wieder heraufzuregulieren, um den Ausgangsphänotyp wieder herzustellen.

In Tumoren besteht ein starker Zusammenhang zwischen Signaltransduktionswegen und fundamentalen metabolischen Wegen, wie Glykolyse und Pentose-Phosphat-Zyklus. Viele tumorfördernde Mechanismen wirken direkt auf die Glykolyse, die zelluläre Antwort auf Sauerstoff und die Fähigkeit von Tumoren neue Gefäße zur eigenen Versorgung zu rekrutieren. Es ist seit Warburg bekannt, dass Tumore beständig anaerobe Wege zur Gewinnung von ATP durch Konvertierung von Glukose nutzen. Ein zytotoxisches Nebenprodukt der Glykolyse ist Methylglyoxal (MGO). Das reaktive MGO bindet in hohen Konzentrationen an Proteine und Nukleinsäuren, wodurch Apoptose induziert wird. Alle Organismen besitzen ein Glyoxalase-Enzymsystem (GLO I / GLO II) um eine Schädigung der Zellen durch hohe MGO-Konzentrationen zu verhindern. Insbesondere in Tumorzellen ist dieses System hochreguliert, um die hohen, parakatalystisch entstehenden MGO-Konzentrationen zu minimieren. Die Inhibierung der Glyoxalasen könnte daher eine wichtige Rolle in der Krebstherapie einnehmen. Bisher bezog sich die Charakterisierung der Glyoxalasen in malignen Tumoren nur auf histochemische Analysen, welche eine Überexpression in Tumoren zeigt. Durch das RNAi-Modell könnten spezifische GLO I-Inhibitoren in Substanzbibliotheken identifiziert werden.

  • AIT Austrian Institute of Technology GmbH, Department of Health & Environment, Nano Systems Business Unit
  • BECIT GmbH
  • DMCE GmbH & Co KG
  • ERT-Optik Dr. Thiel GmbH
  • Fachhochschule Flensburg, Fachbereich Energie und Biotechnologie
  • Forschungszentrum Borstel, Leibniz-Zentrum für Medizin und Biowissenschaften
  • Fraunhofer-Institut für Elektronische Nanosysteme ENAS
  • Fraunhofer-Institut für Grenzflächen- und Bioverfahrenstechnik IGB
  • Fraunhofer-Institut für Zuverlässigkeit und Mikrointegration IZM
  • Hochschule für Technik, Wirtschaft und Kultur Leipzig, Fakultät Elektrotechnik und Informationstechnik
  • Institut für Mikrotechnik Mainz GmbH, Abteilung Mikrofluidik
  • MCMaster University, Hamilton, Kanada
  • Magna Diagnostics GmbH
  • Merck KGaA
  • microfluidic ChipShop GmbH
  • Seoul National University, NANO Systems Institute
  • Siemens AG, Corporate Technology, Electromagnetic Systems and Superconductivity
  • Universität Leipzig, Medizinische Fakultät, Institut für Biochemie
  • Universität Leipzig, Medizinische Fakultät, Institut für Pathologie

Publikationen

  • Sandetskaya N, Moos D, Seifert S, Jenerowicz M, Becker H, Zilch C, Kuhlmeier D. An integrated versatile lab-on-a-chip platform for the isolation and nucleic acid-based detection of pathogens. Future Science OA. 2017 May; 3(2). DOI:10.4155/fsoa-2016-0088
  • Gärtig C, Niemann K, Berthold J, Giel L, Leitschuh N, Boehm C, Roussak L, Vetter K, Kuhlmeier D. Development of a point-of-care-device for fast detection of periodontal pathogens. BMC Oral Health. 2015 Dec 24;15(1):165.
  • Tröger V, Niemann K, Gärtig C, Kuhlmeier D. Isothermal Amplification and Quantification of Nucleic Acids and its Use in Microsystems. Journal of Nanomedicine & Nanotechnology. 01/2015; 6(3). DOI dx.doi.org/10.4172/2157-7439.1000282
  • Sandetskaya N, Engelmann B, Brandenburg K, Kuhlmeier D. Application of immobilized synthetic anti-lipopolysaccharide peptides for the isolation and detection of bacteria. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2015 May 19.
  • Sandetskaya N, Naumann A, Hennig K, Kuhlmeier D. Specific enrichment of prokaryotic DNA using a recombinant DNA-binding protein. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2014 Jun;406(15):3755-62. DOI dx.doi.org/10.1007/s00216-014-7787-7.
  • Sandetskaya N, Allelein S, Kuhlmeier D. Application of nanotechnology in miniaturized systems and its use for advanced analytics and diagnostics - an updated review. Recent Pat Food Nutr Agric. 2013 Dec;5(3):220-38.
  • Becker H, Carstens C, Kuhlmeier D, Sandetskaya N, Schröter N, Zilch C, Gärtner C. Stationary microfluidics: molecular diagnostic assays by moving magnetic beads through non-moving liquids. 20 Mar. 2013; SPIE Digital Library.
  • Sandetskaya N, Lorenzen M, Nachsel R, Pötter H, Kuhlmeier D, Carstens C, Gärtner C, Zilch C. Magnetpartikel-basiertes Mikrosystem zum magnetoresistiven Schnellnachweis Sepsis-relevanter Pathogene. Proceedings MikroSystemTechnik Kongress 2012, VDE-Verlag
  • Kuhlmeier D, Gärtig C. Mit der PCR der Parodontitis auf der Spur. BIOspektrum 02.13.
  • Kuhlmeier D, Sandetskaya N, Lorenzen M, Schotter J. Retter im Scheckkartenformat. Laborpraxis 03/2011.
  • Kuhlmeier D, Sandetskaya N, Allelein S. Application of nanotechnology in miniaturized systems and its use in medical and food analysis. Recent Pat Food Nutr Agric. 4 (2012), 3, S. 187-99. DOI dx.doi.org/10.2174/2212798411204030187.
  • Lindner I. et al. alpha 2-Macroglobulin Inhibits the Malignant Properties of Astrocytoma Cells by Impeding beta-Catenin Signaling. Cancer Research, v. 70 (2010), no. 1, p. 277-287.

Patente

  • Kuhlmeier D, Sandetskaya N, Hennig K, Naumann A. Methode zur spezifischen Isolation von Nukleinsäuren. Patent application PCT/EP2013/072331.