Analysestrategien

Entwicklung neuartiger Biomarker für die Diagnose und Prognose des Prostatakarzinoms

Flow Cell für die Hochdurchsatz-Sequenzierung
© Fraunhofer IZI

Flow Cell für die Hochdurchsatz-Sequenzierung.

Teilautomatisierte Extraktion von Nukleinsäuren (RNA und DNA)
© Fraunhofer IZI

Teilautomatisierte Extraktion von Nukleinsäuren (RNA und DNA).

Aufgrund der demographischen Entwicklung nehmen onkologische, chronisch-entzündliche und degenerative Erkrankungen stetig zu. Deren Therapie ist trotz einer wachsenden Zahl von Behandlungsoptionen oft unbefriedigend. Hier kann eine personalisierte Therapie grundlegende Fortschritte bringen. Voraussetzung dafür ist die präzise Bestimmung der molekularen Basis einer Erkrankung sowie die Vorhersage des individuellen Krankheitsverlaufs und Therapie­ansprechens. Seit der vollständigen Sequenzierung des menschlichen Genoms in 2001 eröffnet die Entschlüsselung krankheitsrelevanter Gene neue Optionen für die Entwicklung maßgeschneiderter Therapieansätze. Neben dem Nachweis von Veränderungen in den DNA-Mustern (z. B. Mutationen), rückt zunehmend die Untersuchung der RNA-Expressionsmuster von Genen, mittels transkriptomweiter Sequenzierung in den Fokus.

Innerhalb des von der Fraunhofer-Zukunftsstiftung geförderten RIBOLUTION-Projekts wurden auf der Grundlage von transkriptomweiter (RNA-) Sequenzierung in Kombination mit Microarray-Analysen neue Biomarker für das Prostata­karzinom identifiziert. Dabei wurden sowohl Biomarker für die Diagnose der Erkrankung, als auch für die Prognose der Aggressivität des Karzinoms gefunden.

Für die Bestätigung und spätere Anwendung als diagnos­tische Biomarker, soll eine überschaubare Anzahl Biomarker mittels eines einfachen Tests nachgewiesen werden. Daher wurde durch die AG RNA-Biomarker ein Workflow für den Nachweis diagnostischer Biomarker im Urin, unter Anwendung der quantitativen Realtime-PCR (qPCR) entwickelt. Für die Optimierung erfolgte u.a. eine ausführliche Testung geeigneter Referenz- und Zielregionen, der Primer und Sonden sowie eine Anpassung der Reaktionsbedingungen. Für die Auswertung wurden die ausgewählten Biomarker, in enger Kooperation mit der AG Bioinformatik, mittels eines eigens entwickelten Algorithmus untersucht.

Für die komplexere Fragestellung der Prognose, entwickelte die AG Analysestrategien einen Workflow, der auf RNA-Sequenzierung aus FFPE-Biopsiematerial beruht. Ziel war es, in klinisch verfügbaren Proben, ein breites Spektrum potenzieller Biomarker nachzuweisen. Im Sinne einer Zeit- und Kosten­reduktion erfolgte eine Optimierung der Sequenzierung hinsichtlich Sensitivität und Robustheit. Auf Grundlage dieses etablierten Vorgehens erfolgt aktuell die transkriptomweite Sequenzierung einer großen Patientenkohorte (n>150), zur Bestätigung der identifizierten Biomarker.

Die im Rahmen des Projekts entwickelten Workflows sollen zukünftig auf weitere Indikationen übertragen werden.

Ribolution

Das Projekt »RIBOLUTION – Integrierte Plattform für die Identifizierung und Validierung innovativer RNA-basierter Biomarker für die Personalisierte Medizin« ist ein von der Fraunhofer-Zukunftsstiftung geförderter Forschungsverbund. Das Projekt wird durch Prof. Dr. Friedemann Horn am Fraunhofer IZI koordiniert.

Im Projekt RIBOLUTION werden durch genomweite Screening-Verfahren neue RNA-Biomarker für komplexe Erkrankungen (z.B. onkologische, chronisch-entzündliche und degenerative Erkrankungen) identifiziert. Dabei erfasst RIBOLUTION auch sogenannte nichtkodierende RNAs, deren Bedeutung als potenzielle Biomarker erst in jüngster Vergangenheit erforscht wurde.

Im Anschluss an die Screening-Phase werden potenzielle Biomarker hinsichtlich ihrer diagnostischen und prognostischen Aussagekraft beurteilt. Interessant sind dabei solche Biomarker, die als diagnostische Indikatoren eine Erkrankung anzeigen oder ihren Verlauf bzw. das Ansprechen auf Therapien prognostizieren können.

Zusätzlich wird der Prozess des Biomarker-Screenings durch RIBOLUTION mit Hilfe technischer Innovationen optimiert und perfektioniert.

Endokarditis

In Kooperation mit dem Herzzentrum Leipzig und dem Institut für Mikrobiologie der Universität Leipzig wird die Fragestellung einer verbesserten Erregerdiagnostik bei einer infektiösen Endokarditis bearbeitet.

Mittels genomweiter Sequenzierung werden Krankheitserreger sowohl direkt auf den infizierten Herzklappen als auch im Blut der Patienten identifiziert und mit den Befunden aus dem mikrobiologischen Analyselabor verglichen.

Ziel ist es, in Ergänzung zu den bereits zur Verfügung stehenden mikrobiologischen Analysen, eine optimierte Behandlungsstrategie für jeden einzelnen Patienten abzuleiten. Dabei stehen vor allem die bisher nur unzureichend abschätzbare Notwendigkeit einer Operation bzw. der Einsatz der passenden Antibiose im Vordergrund.

Mammakarzinom

In einem gemeinsamen Projekt mit der Universitäts-Frauenklinik Essen werden Gene, welche für die Entstehung und die Metastasierung des Mammakarzinoms relevant sind, hinsichtlich ihrer Expressionsmuster und des Auftretens von Mutationen untersucht.

Dafür wurde in der Arbeitsgruppe ein spezieller DNA-Capture-Ansatz entwickelt, der es ermöglicht, krankheitsrelevante DNA-Abschnitte aus Primärtumoren und Metastasen von Patientinnen gezielt anzureichern und nachfolgend zu sequenzieren. Gleichzeitig werden am Klinikum in Essen zirkulierende Tumorzellen (CTCs) aus Patientenblut isoliert, in denen die Expression Mammakarzinom-relevanter Gene mittels PCR untersucht wird.

Die Daten dieser Studien sollen zeigen, wie sich Primärtumore und Metastasen in ihren Mutations- und Expressionsmustern unterscheiden. Zudem wird untersucht, ob CTCs für die Diagnose des Mammakarzinoms genutzt werden können und Hinweise für eine zielgerichtete Behandlung liefern. Dadurch könnten komplizierte operative Entnahmen von Tumorgewebe überflüssig werden.

Funktionelle Analysen zur Rolle von nichtkodierenden RNAs in Multiplem Myelom, Glioblastom und Alzheimer

In den vergangenen Jahren konnte durch genomweites Next-Generation-Sequencing eine Vielzahl an nicht proteinkodierenden RNAs (ncRNAs) identifiziert werden. Viele dieser ncRNAs haben offensichtlich einen Einfluss auf die Entstehung und den Verlauf von Krankheiten. Dennoch ist ein Großteil dieser Transkripte kaum funktionell charakterisiert.

Der Schwerpunkt dieses Projekts liegt daher auf der umfassenden funktionellen Analyse solcher ncRNAs in verschiedenen immunologisch und neurologisch relevanten Zellsystemen. Durch den gezielten Knockdown einer ncRNA ist es in nachfolgenden Untersuchungen möglich, ihren Einfluss auf die Vitalität, Apoptoserate, Proliferation, Adhäsion und Migration von Zellen zu bestimmen. Des Weitern kann die Expression und Lokalisation von ncRNAs innerhalb von Geweben, aber auch auf Einzelzellebene visualisiert und quantifiziert werden. Vertiefend dienen In-vivo-Interaktionsstudien der Identifizierung von ncRNA-Bindungspartnern auf RNA-, DNA- und Proteinebene. Ziel ist es, die molekularen und zellulären Wirkungsmechanismen von ncRNAs aufzuklären, um deren Rolle in diversen Krankheitsmodellen besser zu verstehen und mögliche therapeutische Ansatzpunkte herauszuarbeiten.

Abgeschlossenes Projekt: Diagnostik zirkulierender Tumorzellen

Dieses SAB-geförderte F&E-Verbundvorhaben wurde von der ApoCell Europe GmbH gemeinsam mit verschiedenen Arbeitsgruppen des Fraunhofer IZI durchgeführt. Das Ziel war die Entwicklung innovativer Technologien zur Erfassung und Charakterisierung zirkulierender Tumorzellen. Damit soll die Entwicklung signifikant verbesserter Tumordiagnostika und innovativer Therapien vorangetrieben werden.