MicroRNAs – kleine, etwa 20 Nukleotide lange nicht-proteinkodierende RNAs – spielen eine entscheidende Rolle in lebenswichtigen Prozessen der Zelle. Sie binden an bestimmte Regionen in mRNAs, wodurch deren Translation oder Stabilität und damit die Menge an produziertem Protein reguliert wird. Beim Menschen sind bereits über 600 microRNAs entdeckt worden; die Gesamtzahl an microRNAs im menschlichen Genom ist Schätzungen zufolge jedoch viel höher.

Für eine beachtliche Anzahl an microRNAs konnte gezeigt werden, dass sie eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Erkrankungen, wie z.B. Stoffwechsel- und psychatrischen Erkrankungen, Infektionen und vor allem Krebs spielen.

• Detektion von krankheitsrelevanten microRNAs

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  In vielen krankhaften Zuständen wurde eine Erhöhung oder Erniedrigung der Produktion bestimmter microRNAs festgestellt, besonders häufig in Tumorzellen. Expressionsprofile von microRNAs scheinen daher als diagnostische Marker für Tumorerkrankungen geeignet. Für einige microRNAs wurde gezeigt, dass sie eine zentrale Rolle bei der Regulation tumorrelevanter Prozesse spielen und entweder als Tumorsuppressoren oder Onkogene fungieren können (sogenannte »Oncomirs«).

  MicroRNAs habe folglich sowohl großes Potential als sensitive diagnostische und prognostische Marker wie auch – vielleicht in geringerer Zahl – als therapeutische Targets. Sie erregen daher wachsendes Interesse der angewandten Forschung, was einerseits eine hohe Nachfrage nach Methoden für die Identifikation, Quantifizierung und funktionelle Charakterisierung generiert. Inhibitoren für einen möglichen therapeutischen Einsatz leiten sich direkt von der Sequenz ab, eine vorhergehende Identifizierungs- und Optimierungsphase könnte daher entfallen und der Weg vom validierten Target zur klinischen Erprobung sehr kurz sein.

  Mehrere Technologien zu Identifizierung und Quantifizierung von microRNAs wurden mittlerweile am Fraunhofer IZI etabliert und werden neben dem Einsatz für die eigene Forschung als Dienstleistung angeboten. Dazu gehört zum einen die Durchführung von Array-basierten Expressionsanalysen, welche die parallele Detektion aller momentan bekannten microRNAs (aufgeführt in der Sanger Database) ermöglicht. Eine weitere, sehr genaue Möglichkeit zur Expressionsanalyse von microRNA stellt die realtime-PCR-Technik dar. Über ein spezifisches Verfahren werden die kurzen microRNA-Moleküle so markiert, dass eine quantitative Detektion möglich wird. Mittels miRNA »Low Density Arrays« von Applied Biosystems bieten wir auch die parallele Detektion von 360 miRNAs mittels quantitativer PCR an – ein Verfahren, das Vorteile von Array- und PCR-basierter Detektion teilweise vereint.

• Funktionelle Charakterisierung von microRNAs

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  Der überwältigenden Anzahl an neu gefundenen microRNAs steht die Aufgabe gegenüber, deren möglichen Einfluss auf physiologische Prozesse zu untersuchen. Einige microRNAs wurden bereits als wichtige Regulatoren und Modulatoren in zellulären Prozessen, wie bspw. Zellwachstum und Proliferation, Apoptose, und Koordinierung von Entwicklungsprozessen, gefunden. Eine umfassende funktionelle Charakterisierung der durch bestimmte microRNAs ausgelösten physiologischen Effekte kann die Nutzung dieser Moleküle als therapeutische Targets ermöglichen.

  Eine funktionelle Charakterisierung von einzelnen microRNAs, die beispielsweise durch eine Expressionanalyse als dereguliert in kranken gegenüber gesunden Zellen identifiziert wurden, kann über Manipulation des Expressionsspiegels erfolgen. Dies wird durch den Einsatz von Vektoren, die zur Überexpression von bestimmten microRNAs in Zellen führen, möglich. Eine weitere Möglichkeit ist der Einsatz von sogenannten Antagomirs – kurze, synthetische Nukleinsäuremoleküle, die gegen die Ziel-microRNA gerichtet sind, der zu einer sehr effizienten Stillegung von microRNAs in der Zelle führt. Anschließend werden die durch Manipulation der microRNA ausgelösten physiologischen Effekte, wie bspw. eine Erhöhung oder Senkung der Apoptose- oder Proliferationsrate, über Standardmethoden analysiert.

  Zusammen mit Forschern der Universität Leipzig wurde bereits eine deregulierte microRNA entdeckt, die in einer hämatologischen Krebsart (Multiples Myelom) den kontrollierten Zelltod verhindert und so zum krankhaften, verlängerten Überleben der Tumorzellen beiträgt (Loffler et al, Blood, 2007). Diese microRNA wir derzeit funktionell charakterisiert und auf ihre Eignung als therapeutisches Target hin untersucht.

• Identifizierung von microRNA-Targets

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  Die Entstehung und Wirkung von microRNAs ist mittlerweile sehr umfassend beschrieben worden; weitaus weniger ist darüber bekannt, welche Ziel-mRNAs durch die jeweiligen microRNAs tatsächlich in ihrer Translation oder Stabilität beeinflusst werden. Neben bioinformatischen Methoden zur Vorhersage existieren auch verschiedene experimentelle Ansätze zum Nachweis von Ziel-mRNAs von microRNAs; diese sind allerdings zum großen Teil ausschließlich für die Analyse von einzelnen mRNA / microRNA-Paaren geeignet; die Entwicklung einer Methode die sich für Hochdurchsatz-Fragestellungen eignet steht noch aus. Dabei ist gerade im Zusammenhang mit der Krankheitsassoziation von microRNAs wichtig zu wissen, welche Gene durch die Fehlregulation einer microRNA in ihrer Expression inhibiert werden.

  Mit Hilfe von bioinformatischen und experimentell-biologischen Techniken, die am Fraunhofer IZI entwickelt wurden bzw. in Entwicklung befindlich sind, wird eine umfassende Analyse von mRNA-Targets, die durch einzelne microRNAs reguliert werden, möglich.

• Custom-Array-Analyse von vorhergesagten microRNAs

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  Momentan sind ungefähr 600 menschliche microRNAs nachgewiesen worden (Sanger Database 9.1); allerdings gehen Schätzungen davon aus, dass die tatsächliche Anzahl an microRNA-Genen im menschlichen Genom noch viel höher ist.

  Am Fraunhofer IZI werden Methoden zu Identifizierung neuer, bisher unbekannter microRNAs entwickelt und angewendet. Dies geschieht in enger Zusammenarbeit mit Bioinformatikern der Universitäten Wien und Leipzig durch die Anwendung bioinformatische Vorhersagemethoden. Auf diese Weise wurden bereits mehrere tausend neuer microRNA-Kandidaten identifiziert.

  Diese microRNA-Kanditatengene werden am Fraunhofer IZI über maßgeschneiderte Hochdurchsatz-Nukleinsäuredetektionsverfahren (Custom-Arrays) hinsichtlich ihrer Expression validiert; anschließend werden die Kandidaten auf funktionelle Merkmale von miRNAs hin untersucht, um sicherzustellen, dass diese neuen Transkripte tatsächlich zur Klasse der microRNAs gehören.

  In einem Projekt mit der Firma Affymetrix und der Bioinformatik Gruppe an der Universität Leipzig wurden potenzielle microRNAs durch eine unvoreingenommene Methode zur Transkript-Identifizierung detektiert. Dabei konnten in zwei Tumorzelllinien insgesamt 400.000 kleine RNAs identifiziert werden, die sowohl microRNAs als auch andere kleine ncRNAs darstellen (Kapranov et al, Science, 2007).

Jüngste Studien des Transkriptoms zeigen, dass zwar nahezu alle Bereiche des Genoms abgelesen werden können, aber in unterschiedlichen Zelltypen jeweils nur ein geringer Anteil des Genoms gleichzeitig exprimiert wird (Zelltypspezifität); dabei scheinen nicht-proteinkodierende RNAs (ncRNAs) einen Großteil dieser spezifischen Transkripte zu bilden.

ncRNAs spielen in zahlreichen zellulären Prozessen eine wichtige Rolle, insbesondere in regulatorischen Prozessen wie Differenzierung oder Apoptose- und Zellzykluskontrolle. Es ist daher wenig überraschend, dass bereits eine beachtliche Anzahl verschiedener krankheits- und insbesondere tumorassoziierter ncRNAs identifiziert werden konnte. ncRNAs stellen damit sowohl eine wichtige Gruppe potentieller diagnostischer Marker wie auch mögliche Drug-Targets dar.

• Tiling Array-Analyse der ncRNA Expression

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  Nach Abschluss des humanen Genomprojektes – also der Sequenzierung des menschlichen Genoms – stellte sich die Frage, welche Rolle jene ca. 98.5% der DNA spielen, die nicht als Bauplan für Proteine dienen. Im ENCODE Projekt (The ENCODE project consortium) konnte unter Beteiligung der RNomics Gruppe gezeigt werden, dass der Großteil dieser nicht kodierenden Regionen in RNA übersetzt werden dürfte. Da diese RNAs in Ihrer Expression sehr strikt reguliert und charakteristisch für eine bestimmte Zelle zu sein scheinen, ist deren Erfassung für zukünftige diagnostische und möglicherweise auch therapeutische Anwendungen von Interesse.

  Wie aber identifiziert und quantifiziert man völlig unbekannte Transkripte? Zum einen durch Sequenzierung, oder durch den Einsatz sogenannter Tiling Arrays. Tiling Arrays ermöglichen dabei das physikalische Auslesen eines Genoms und können als nützliches Werkzeug z.B. zum Mappen von Bindestellen von Protein-DNA-Interaktionen über Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)-Experimenten, zur Identifizierung von neuen RNA-Transkripten oder zum Erweiterung des Verständnisses globaler epigenomischer Veränderungen, wie Methylierung oder Acetylierung, eingesetzt werden.

  Tiling Arrays sind so aufgebaut, dass sie die Bereiche von nicht-repetitiven Sequenzen der Genome – unabhängig davon, ob eine kodierende oder eine nicht-kodierende Region vorliegt - durch 25-mer Oligonukleotidsonden abdecken (siehe Abbildung).

  Am Fraunhofer IZI werden Tiling Array Analysen verschiedener Zellsysteme mit dem Ziel der Identifizierung neuer krankheitsrelevanter ncRNAs durchgeführt. Die durch diese unvoreingenommene Analysemethode gewonnenen Daten können anschließend zur Entwicklung von neuen Biomarkern oder – nach funktioneller Charakterisierung – von neuen therapeutischen Targets genutzt werden.

• Analyse von Tiling Array und Ultra-Hochdurchsatz-Sequenzierungs Genexpressionsdaten

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  Genomweite Tiling Arrays und Ultra-Hochdurchsatz-Sequenzierung stellen derzeit die einzigen effizienten Methoden zur unvoreingenommenen, genomweiten Detektion von Transkription dar. Unvoreingenommen bedeutet in diesem Fall, dass bekannte wie neue, unbekannte Transkripte gleich effizient bestimmt werden können.

  Während die experimentelle Seite genomischer Tiling Arrays gut etabliert ist, stellt die Analyse der gewonnen komplexen Datensätze eine Herausforderung dar – die Methodenentwicklung ist in diesem Bereich keineswegs abgeschlossen. Existierende Ansätze zur Tiling Array Datenanalyse verzichten entweder teilweise auf den stärksten Vorteil der Methode, nämlich Unvoreingenommenheit, oder erlauben nur qualitative aber keine quantitativen Aussagen zur Genexpression.

  Letzteres Problem entsteht vor allem dadurch, dass bei Tiling Arrays kein Sondendesign betrieben werden kann. Damit hängt das Signal jeder Sonde nicht nur von der Konzentration der RNA sondern auch stark von der Sequenz der Probe ab; diese Abhängigkeit bleibt in den Normalisierungsalgorithmen für Expressions-Tilingarrays bisher unberücksichtigt.

  In Kooperation mit PD Dr. Hans Binder vom Interdisziplinären Zentrum für Bioinformatik der Universität Leipzig entwickeln werden Methoden zur Analyse von Tiling Array-Daten, die sowohl die Sequenzabhängigkeit der Sonden, als auch Sättigungseffekte berücksichtigen, unvoreingenommen arbeiten und dadurch quantitative Aussagen erlauben.

  Eine alternative Vorgesehenweise zur Transkriptommessung ist das Ultra-Hochdurchsatz-Sequenzieren (UHTS) von Transkripten. Hierbei liegt ein Auswerteproblem vor allem darin, große Zahlen von meist kurzen Stücken zu assemblieren und auf entsprechende Genomsequenzen zu mappen.

  Eine Gemeinsamskeit von Tiling Array und UHTS Genexpressionsdatensätzen liegt in der Notwendigkeit, aus Expressionssignalen entlang des Genoms Transkripte und Transkriptstrukturen rekonstruieren zu müssen. Hierfür werden Methoden gemeinsam mit dem Interdisziplinären Zentrum für Bioinformatik der Universität Leipzig entwickel

• Funktionelle Charakterisierung und Annotation von langen ncRNAs

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  Die ständig wachsende Anzahl an ncRNAs, die krankheits- oder entwicklungsabhängig abhängig reguliert zu sein scheinen, verlangt nach Methoden für deren funktionelle Charakterisierung. Während für die ca. 20 Nukleotide langen microRNAs effiziente Verfahren zur funktionellen Charakterisierung, beispielsweise für Überexpression und Knock-down zur Verfügung stehen, fehlen etablierte Methoden für die heterogene Gruppe längerer ncRNAs.

  Am Fraunhofer IZI wird im Rahmen nationaler und internationaler Zusammenarbeiten an Projekten gearbeitet, um die Funktionen von ncRNAs zu verstehen und zu nutzen. Dazu werden Strategien entwickelt und verfeinert, um die jeweilige ncRNA in den Zellen auszuschalten. Hierbei wird eine Kombination von bioinformatischen und experimentellen Verfahren verwendet, um beispielsweise die effizienteste Knock-down Methode vorherzusagen und danach experimentell umzusetzen.

  Analog werden Techniken entwickelt, um die entsprechenden ncRNAs – ähnlich der Überexpression von proteinkodierenden Genen – in den Zellsystemen künstlich zu produzieren oder einzubringen.

  Im Anschluss an Überexpression oder Knock-down werden die durch Manipulation des ncRNA Spiegels ausgelösten physiologischen Effekte, wie beispielsweise eine Erhöhung oder Senkung der Apoptose- oder Proliferationsrate, Invasivität, oder Änderungen des Proteinprofils analysiert.

  Werden im Rahmen genomweiter Transkriptionsanalysen, wie beispielsweise in im ENCODE Projekt (The ENCODE project consortium, Nature, 2007) oder in Kollaboration mit Affymetrix (Kapranov et al, Science, 2007) große Zahlen von ncRNAs identifiziert, müssen effiziente bioinformatische Auswahlverfahren angewandt werden um Mengen von ncRNAs festzulegen, die experimentell charakterisiert werden können. Hierfür verwenden wir verschiedenste Annotationsverfahren, wie beispielsweise in The Athanasius F. Bompfünewerer Consortium (J Exp Zoolog B Mol Dev Evol, 2007) zusammengefasst. Diese Verfahren dienen unter anderem dazu, bekannte ncRNAs, ncRNAs die zu bekannten Klassen gehören, Ähnlichkeiten zu anderen bekannten RNAs aufweisen oder Gruppen von strukturell ähnlichen ncRNAs herauszufiltern.