Reportergen-Assays sind in der modernen Forschung vielseitig verwendbar. Sie dienen vorrangig zur Charakterisierung regulatorischer Elemente (Promoter-Regionen) oder Modulatoren (Transkriptionsfaktoren) auf genomischer Ebene. Insbesondere Luciferase-basierte Reportergen-Assays sind heute in der biomedizinischen und pharmakologischen Forschung etabliert. Aufgrund der sehr niedrigen Nachweisgrenze konnten sie sich gegenüber fluoreszenzbasierten Reportergenen durchsetzen. Prinzipiell wird das zu untersuchende regulatorische, genetische Element vor ein Luciferase-Gen kloniert. Das Reportergenkonstrukt kann mittels herkömmlicher Transfektionsmethoden in ein ausgewähltes Zellsystem eingebracht werden. Die biologische Aktivität des klonierten genetischen Elements kann nun zeitabhängig charakterisiert werden. Das Fraunhofer IZI bietet ein komplettes Dual-Luciferase-System an, welches sich zur Untersuchung von genetischen, regulatorischen Elementen aus Säugetiergenomen eignet.

Methode

Die Methode beinhaltet drei Schritte:

• Klonierung und Sequenzierung der Targetsequenz in das Reporterkonstrukt
• Transfektion vom ausgewählten Zellsystem mit dem Reporterkonstrukt
• Messung der biologischen Aktivität

optional:

• Gabe von externen Stimulantien (z.B. Wirkstoffe) oder veränderte Kulturbedingungen (z.B. Hypoxie)
• Generierung von Deletionsmutanten

Referenzprojekt

Im Rahmen einer kooperativen Arbeit mit der Abteilung Allgemeine Biochemie der Universität Leipzig konnte die Aktivität des humanen GLO1-Promoters in verschiedenen Karzinom-Zelllinien untersucht werden. Derzeit wird der Einfluss von Hypoxie auf die Promoteraktivität untersucht.

Ausgewählte Applikationen

Das System dient zur funktionellen Charakterisierung jedes erdenklichen regulatorischen Elements aus Säugergenomen. Zudem bietet das System die Möglichkeit zur Untersuchung von exogenen Faktoren in Kombination mit normalen oder veränderten Kulturbedingungen.

RNAi ist ein konservierter Mechanismus, welcher die Genexpression auf posttranskriptioneller Ebene reguliert. In Eukaryoten wird doppelsträngige RNA (dsRNA) zu kurzen, kleinen interferierenden RNAs (siRNA) prozessiert, welche die Degradierung der komplementären mRNA zur Folge hat. Dies führt letztendlich zur effektiven Herabregulierung des spezifischen Proteins. Diese charakteristischen Eigenschaften führen zur Anwendung RNAi in Zellkulturen sowie in Tiermodellen. Die spezifische Unterdrückung der Genexpression und Proteinaktivität modelliert die pharmakologische Inhibierung des Zielproteins und ist daher ein effektives Werkzeug für proof-of-principle-Experimente sowie die Identifizierung und Validierung von antitumoralen Wirkstoffen.

Im Rahmen des Referenzprojekts soll ein bereits identifiziertes Zielprotein für eine neuartige Krebstherapie mit der Bezeichnung Glyoxalase I (GLO I) spezifisch durch RNAi stufenweise herabreguliert werden. Zudem soll das System die Möglichkeit bieten, die GLO1 wieder heraufzuregulieren, um den Ausgangsphänotyp wieder herzustellen.

In Tumoren besteht ein starker Zusammenhang zwischen Signaltransduktionswegen und fundamentalen metabolischen Wegen, wie Glykolyse und Pentose-Phosphat-Zyklus. Viele tumorfördernde Mechanismen wirken direkt auf die Glykolyse, die zelluläre Antwort auf Sauerstoff und die Fähigkeit von Tumoren neue Gefäße zur eigenen Versorgung zu rekrutieren. Es ist seit Warburg bekannt, dass Tumore beständig anaerobe Wege zur Gewinnung von ATP durch Konvertierung von Glukose nutzen. Ein zytotoxisches Nebenprodukt der Glykolyse ist Methylglyoxal (MGO). Das reaktive MGO bindet in hohen Konzentrationen an Proteine und Nukleinsäuren, wodurch Apoptose induziert wird. Alle Organismen besitzen ein Glyoxalase-Enzymsystem (GLO I / GLO II) um eine Schädigung der Zellen durch hohe MGO-Konzentrationen zu verhindern. Insbesondere in Tumorzellen ist dieses System hochreguliert, um die hohen, parakatalystisch entstehenden MGO-Konzentrationen zu minimieren. Die Inhibierung der Glyoxalasen könnte daher eine wichtige Rolle in der Krebstherapie einnehmen. Bisher bezog sich die Charakterisierung der Glyoxalasen in malignen Tumoren nur auf histochemische Analysen, welche eine Überexpression in Tumoren zeigt. Durch das RNAi-Modell könnten spezifische GLO I-Inhibitoren in Substanzbibliotheken identifiziert werden.

Komplexe und lebensbedrohliche Infektionserkrankungen (z.B. Sepsis) können derzeit nur mit aufwändigen, zeitraubenden Verfahren unter Einschaltung eines Analyselabors und mit qualifizierten Fachkräften zuverlässig diagnostiziert werden. Die Gruppe entwickelt in Kooperation mit europäischen Partnern ein innovatives System zur schnellen, einfachen und kostengünstigen Infektionsdiagnostik direkt vor Ort.

Das System basiert auf magnetischen Partikeln im Mikrometermaßstab, die je nach Anwendungsbereich als Träger für Antikörper und krankheitsassoziierte DNA-Sequenzen funktionalisierbar sind. Diese Magnetpartikel werden auf einem scheckkartenähnlichen Disposable eingesetzt. Bei der Vor-Ort-Untersuchung wird dem Patienten eine Probe entnommen, etwa Blut, Speichel oder Urin, die dann in das Lab-on-chip-System integriert wird. Die Magnetpartikel binden nach Aufbruch der Zielzellen an die entsprechenden Zielmoleküle in der Probe und werden mit Magnetkraft vollautomatisch durch verschiedene Reaktionsgefäße transportiert. Am Ende der Prozesskette erfolgt die Diagnose mittels hochempfindlicher Magnetosensorik.

Das Projekt wird durch das Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) gefördert und durch die Magna Diagnostics GmbH, einer Ausgründung des Fraunhofer IZI, koordiniert.

Einfache Teststreifensysteme zum schnellen Nachweis klinisch relevanter Parameter oder zur Qualitätssicherung von Lebensmitteln werden nicht nur in Entwicklungsländern immer wichtiger. Wir erarbeiten eine simple diagnostische Plattform, die sich besonders für nukleinsäure-basierte Formate eignet. Als Referenzassay werden pathogene Erreger in humanen Proben diagnostiziert.

Eine Vielzahl verschiedener Proteine zeigen spezifische DNA-bindende Eigenschaften, die mit gezielten zellulären Funktionalitäten verknüpft sind. Wir nutzen Zinkfinger-Proteine, die definierte Nukleinsäuresequenzen binden und als immobilisierte Elemente eines Proteinarrays doppelsträngige DNA aus Probelösungen fangen können.

Des Weiteren fokussieren wir uns auf funktionelle Proteine, die Nukleinsäuren pathogener Erreger aus einem Überschuss humaner DNA isolieren können. Diese Proteine sollen Einsatz in neuartigen Aufreinigungsverfahren finden.

Parodontitis ist eine entzündliche Erkrankung des Zahnhalteapparats, die unbehandelt zum Zahnausfall führen kann. Allein in Deutschland wird prognostiziert, dass fast 12 Millionen Menschen von Parodontitis betroffen sind. Ursächlich wird die Parodontitis durch bakteriellen Plaque ausgelöst, der in einen Abbau des dentalen Knochengewebes münden kann. Intensiv untersucht wird ein systemischer Zusammenhang zwischen vorkommenden Parodontitis-Erregern und Herz-Kreislaufschädigungen, der schwerwiegende Erkrankungen wie Herz- oder Schlaganfälle auslösen könnte.

Ziel des Parodontitis-Chip-Projekts ist die Entwicklung einer vollintegrierten Diagnostikplattform sowohl für die schnelle Aufbereitung als auch der anschließenden Analyse von parodontal-pathogenen Erregern in komplexen Proben. Diese innovative Technologieplattform besteht aus einer kompakten mikrofluidischen Karte und einem kombinierten Aufreinigungsmodul, in denen die Arbeitsschritte der Isolation der Keime, gezielte Vervielfältigung der DNA-Sequenzen und deren Detektion ablaufen. Der Parodontitis-Chip soll dem Anwender die Möglichkeit geben, elf relevante Bakterien, die bei der Entstehung der Parodontitis eine wesentliche Rolle spielen, in einem integrierten, sogenannten Lab-on-a-chip-Format parallel nachzuweisen und zu charakterisieren. Zusätzlich erfolgt die Etablierung eines einfachen Meßsystems, das ein Monitoring der Reaktionskinetik ermöglichen wird. Damit soll eine Quantifizierung der Erreger sowie eine Bestimmung der Gesamtkeimzahl realisiert werden.

Mit dem Parodontitis-Chip entsteht eine einfache molekulardiagnostische Testplattform, die leicht auf verschiedene Fragestellungen im Bereich der medizinischen-, umwelt- oder Lebensmittelanalytik angepasst werden kann. Vereinfachte Lab-on-a-chip-Entwicklungen können durch einen extrem simplen Aufbau und der Integration berührungsfreier Detektionsverfahren zu einer deutlichen Zeit- und Kostenersparnis für den Anwender führen.

• Beitrag zum Parodontitis-Chip im ARD Mittagmagazin, 12. März 2013